长非编码RNA_NEAT1...参与瘢痕疙瘩形成的调控机制_谢彤阳.pdf

河南医学高等专科学校学报 （），（）：，（）：周强，周维彬，钟凯，等 多层 在囊腔型肺癌及空洞型肺结核诊断中的价值 生物医学工程与临床，（）：童成文，刘源源，兰姗，等 例含囊腔性肺癌多层螺旋 表现 临床肺科杂志，（）：曾庆球，王伟洪，童照威，等 肺结核患者肺部空洞形成与免疫及营养状态的相关性分析 中华临床感染病杂志，（）：收稿日期：修回日期：作者简介：谢彤阳（），男，河南省焦作市人，硕士在读，从事皮肤学研究工作。通信作者：卫艳萍，：。长非编码 通过 参与瘢痕疙瘩形成的调控机制谢彤阳，卫艳萍，王廷廷，张宁宁，李关芳（新乡医学院，河南 新乡；焦作市人民医院皮肤科，河南 焦作）摘要 目的 探讨长非编码 在瘢痕疙瘩中表达情况及参与瘢痕疙瘩形成的调控机制。方法 收集 例瘢痕疙瘩组织作为观察组，例瘢痕疙瘩旁的正常皮肤组织作为对照组，采用实时荧光定量（）检测其、的表达水平。取对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞（）或 细胞，随机分为空白对照组（组）、阴性对照组（组）、组、组、组、组。组、组、组、组细胞应用脂质体转染法分别进行、阴性对照质粒转染，组细胞不作处理。检测各组细胞中 和 的相对表达量。法检测细胞增殖。使用生物信息学分析预测 与 及 与 的结合位点，通过双荧光素酶报告基因实验确认 与 及 与 的靶向作用。过表达 的拯救实验，检测沉默 和上调 的细胞增殖抑制效应的变化。结果 与对照组比较，观察组中 表达升高（），而 的表达异常下调（）；沉默 表达可以显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，升高 的表达；靶向负调控；靶向负调控；过表达 可拯救沉默 和上调 表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制作用。结论 的表达在瘢痕疙瘩组织中异常升高，沉默 可通过 轴降低瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，抑制瘢痕疙瘩的形成和发展。关键词 瘢痕疙瘩；增殖；长非编码 ；中图分类号 文献标识码 文章编号（），（，；，）河南医学高等专科学校学报第 卷 ，（）（）（），（），（），（）；，；瘢痕疙瘩是由皮肤损伤后异常纤维增生反应产生，其典型病理改变是成纤维细胞的异常增生及细胞外基质的沉积。瘢痕疙瘩通常稍高出皮肤的表面，一般伴有瘙痒或疼痛。有研究表明，瘢痕疙瘩的形成和发展与生长因子、基因调控、免疫因素及胶原代谢异常等相关。瘢痕疙瘩发病的分子机制目前尚不清楚。因此，探讨瘢痕疙瘩的发病机制和潜在的治疗靶点具有重要意义。长非编码 是一类含有超过 个核苷酸的非编码，参与细胞基因表达调控，在生理和病理调控中都发挥重要生物学作用。近来有研究报道，可以抑制肾癌细胞生长；还具有抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用。贾春英等探讨 调控 通路在瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的作用。但是 在瘢痕疙瘩形成中的作用和分子机制尚未明确。已有报道表明，在瘢痕疙 瘩 纤 维 增 生 过 程 中 起 着 重 要 的 调 控 作用，。是表皮生长因子受体（）家族成员之一。是存在于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞和角质细胞等细胞表面的受体，对细胞生长、增殖和分化的生理过程发挥重要的作用，在瘢痕疙瘩的形成和发展中发挥重要作用。我们通过生物信息学分析预测：靶向调控，是 的靶基因。为了探讨 在瘢痕疙瘩形成中的作用以及 通过 轴参与瘢痕疙瘩形成的调控机制，本研究检测瘢痕疙瘩标本中、的表达水平，观察沉默 表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的作用，分析 与 和 与 的靶向关系。第 期谢彤阳，等 长非编码 通过 参与瘢痕疙瘩形成的调控机制 材料与方法 材料 临床 例样本采集通过焦作市人民医院伦理委员会批准，并签订知情同意书。均为确诊患者的瘢痕疙瘩手术切除标本，其中瘢痕疙瘩组织作为观察组，瘢痕疙瘩旁的正常皮肤组织作为对照组；纳入标准：参照林简等研究瘢痕疙瘩取材的标准。例临床标本其中男 例，女 例，年龄（）岁。标本离体后迅速放入液氮保存。方法 主要实验材料 瘢痕疙瘩成纤维细胞（）、细胞购于杭州仟诺生物科技有限公司。胎牛血清、培养基购于北京索莱宝公司。购于美国 公司。试剂盒购于上海碧云天公司。试剂、逆转录试剂盒购于美国 公司。、载体、报告基因载体购于上海吉玛公司。引物由上海生工公司合成。荧光定量 仪、培养箱购于美国赛默飞世尔科技公司。细胞培养与转染（或）接种于含胎牛血清的 培养液内，放置于恒温 培养箱中进行细胞培养。待细胞生长 融合度时，更换无血清培养基，依据实验将、报告基因载体按照不同分组分别用 包裹，依照试剂说明书条件进行转染，转染 后更换新鲜含有 胎牛血清的培养基继续培养，进行后续实验。实时荧光定量（）用 试剂提取组织或细胞的总，使用逆转录酶试剂盒进行逆转录，合成。分别以 和 作为内参照，扩增 和。扩增条件：预变性 ；变性 ，退火 ，延伸 循环 圈；使用 法计算产物相对表 达 量。上 游 ，下游；上 游，下游；上 游 ；下游；上游 ，下 游 。法检测细胞增殖活力将各组细胞分别接种 孔板细胞培养板，每孔接种 个细胞。培养后，在每孔细胞中加入 的 溶液，继续培养 ，波长 测定各孔细胞的吸光度值（）。双萤光素酶报告基因检测 应用 数据 库 通 过 生 物 信 息 分 析 预 测 与、存在结合位点。将含有预测结合位点的 野生型报告基因载体（）或突变型报告基因载体（）分别与 或 共转染入 细胞。将含有预测结合位点的 野生型报告基因载体（）或突变型报告基因载体（）分别与 或 共转染入 细胞。转染 后，按照双荧光素酶检测试剂盒说明进行双荧光素酶活性检测。统计学处理 应用 统计软件处理数据，计量资料以均数标准差（）表示，两组间比较采用 检验，不同时段比较采用重复测量资料方差分析，为差异有统计学意义。结果 组、表达比较检测、的表达情况，结果显示：观察组中 的表达高于对照组（），而 表达低于对照组（）。见表。表 组、表达比较（，）组别观察组对照组 值 值沉默 表达对 细胞增殖和 表达的影响 结果显示：转染 细胞组（组）的 的表达水平与未转染细胞组（组）和转染 无关序列细胞对照组（组）相比均显著降低（）；说明瘢痕疙瘩成纤维细胞中的 表达沉默有效。结果显示：在、时，组细胞 值与 组、组相比均显著降低河南医学高等专科学校学报第 卷（）；提示沉默 表达可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。检测 组 表达水平结果显示：与 组和 组相比，组细胞的 表达水平显著升高（）。见表。表 沉默 表达对 细胞增殖和 表达的影响（）组别 组 组 组）值 值 注：）组与 组比较，。生物信息学分析及双荧光素酶报告实验上步实验结果显示，下调 表达可以显著升高 表 达。生 物 信 息 学 分 析 结 果 显 示：上存在与 结合位点。见图。双荧光素酶报告实验结果显示，野生型 报告基因载体（）和 共转染细胞的荧光素酶活性与 组比较均降低（）。见表。图 生物信息学分析预测结果表 双荧光素酶报告实验结果（）组别 组 组 值 值 数据库中预测的结合位点和双荧光素酶报告实验 数据库中预测结果显示：存在与 结合位点。见图。双萤光素酶报告实验结果显示：与 组比较，野生型报告基因载体（）与 共转染细胞的荧光素酶活性显著降低（）。见表。图 数据库中预测的结合位点表 双荧光素酶报告实验结果（）组别 组 组 值 值 对沉默 和上调 的细胞增殖抑制效应的影响 结果显示：过表达 与沉默 共转染组（）在、与单独沉默 转染组（）相比，值显著升高（）。过表达 与上调 共转染组（）在、与单独上调 转染组（）相比，值显著升高（）。见表。表 对沉默 和上调 的细胞增殖抑制效应的影响（）组别 组组 组 组）组）值 值 注：组与 组比较，），）；组与 组比较，）。讨论本研究证实，瘢痕疙瘩组织中 的表达升第 期谢彤阳，等 长非编码 通过 参与瘢痕疙瘩形成的调控机制高。等检测了 例瘢痕疙瘩组织和 例正常皮肤组织中的 表达水平，结果显示在瘢痕疙瘩组织 的表达显著升高。等报道增生性瘢痕组织中的 表达水平显著高于正常皮肤组织。以上结果表明，的表达在瘢痕疙瘩组织中异常升高。本研究结果显示，沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞中 表达，可显著抑制细胞的增殖。等的文献报道，同样是敲低 表达可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭。等研究也表明，的基因敲除抑制细胞的活性和增殖。上述实验提示 在瘢痕疙瘩的形成和发展起到重要作用。等研究结果显示，瘢痕疙瘩组织和瘢痕疙瘩成纤维细胞中 的表达下调，与本文 例瘢痕疙瘩标本中 的表达实验结果一致；且与本研究结果都显示，过表达 可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖；提示 在瘢痕疙瘩形成中可能扮演抑制作用。等研究证明，沉默通过调节 轴抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的存活、迁移和细胞外基质的表达；等研究提示，敲减 可通过调节 轴抑制增生性瘢痕的形成。本研究通过生物信息学预测和双荧光素酶报告实验，以及沉默 对瘢痕疙瘩成纤维细胞 表达的影响检测，证实 靶向负调控；又通过生物信息学预测和双荧光素酶报告实验，证实 靶向负调控；最后通过拯救实验，证实了 可拯救沉默 和上调 的细胞增殖抑制效应，证明了 可通过 轴参与瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖调控。本研究发现了 在瘢痕疙瘩形成中不同的调控机制。综上所述，的表达在瘢痕疙瘩组织中异常升高，沉默 可通过 轴降低瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，抑制瘢痕疙瘩的形成和发展，该通路有望成为瘢痕疙瘩疾病的潜在治疗靶点。参考文献 林简，刘晓红，王荣坤，等 在瘢痕疙瘩中的表达及与 的靶向关系探讨中国美容医学，（）：，（）：，（）：，（）：高蜜阳，张荣明，熊亮，等长链非编码 对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究中国现代医学杂志，（）：李嫚，温晓东，张立燕，等 轴在瘢痕疙瘩形成过程中的分子机制实用医学杂志，（）：李永志，张铖，裴俊鹏，等长链非编码 促进胃癌的增殖、侵袭和迁移中国医科大学学报，（）：钟潇，黄龙，朱蜀侠 靶向 抑制肾癌细胞生长的实验研究现代肿瘤医学，（）：魏涛，冯连杰，付小娜，等 通过靶向 调控乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的实验研究湖北科技学院学报（医学版），（）：，贾春英，张荣明长链非编码 对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响及作用机制实用医学杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）（）（）（），（）：