PCR检测冷冻食品中“活的非可培养状态”的副溶血弧菌.pdf

?流行病学研究?PCR 检测冷冻食品中 活的非可培养状态!的副溶血弧菌龚玉姣,贺征,陈建东,区继军,杨智聪?摘要?目的 比较应用传统培养和 PCR 技术检测引起食物中毒的食品和患者肛拭子副溶血弧菌的方法。方法 按照国家标准 GB4789和有关规范采集引起食物中毒的食品和患者样品,采用传统培养方法分离鉴定病原菌,并结合分子生物学技术提取食品和患者样品的总 DNA、PCR 扩增病原菌特异性基因。结果 12 份患者肛拭子样品中有 8份样本分离培养出同一血清型 O3:K6 的副溶血弧菌,8份样本 PCR 扩增副溶血弧菌毒力基因结果也呈阳性;患者食用过的海鲜等 18 份冷冻食品采用传统培养方法均未分离到活的副溶血弧菌,但其中有 2 份食品 PCR 扩增结果呈阳性。结论 本研究表明,患者的肛拭子用传统培养方法分离鉴定副溶血弧菌结果与 PCR 扩增结果一致;而冷冻的海鲜食品中副溶血弧菌也许进入了 活的非可培养(VBNC)!状态,难以通过分离培养方法检测出来,但用PCR 技术能扩增出其存在的特异性基因,从而提高检测病原菌的敏感性。?关键词?副溶血弧菌;传统培养;PCR 检测;冷冻食物;活的非可培养状态中图分类号:R155?55,R378?3 文献标识码:A 文章编号:1009?6639(2010)10?0988?03Detection of viable but non?culturable Vibrio parahaemolyticus in frozen food by reversetranscription PCR GON G Yu?jiao,H E Zheng,CH EN Jian?dong,OU Ji?j un,YA NG Zhi?cong?Guangz hou Municipal Center f or Disease Prevention and Control,Guangdong 510080,ChinaCorresp onding author:YA NG Zhi?cong,E?mail:gdgzcdc 21cn?com?Abstract?Objective To detect Vibrio parahaemolyticus from food samples leading food borne diseaseand anal swabs of patients with classic culturing and PCR technique?Methods A12 anal swabs of clini?cal patients and 18 samples of left food that patients ate were collected following the national standardprocedure of GB4789?The samples were tested for pathogens with classic culturing method and also RT?PCR for special genes?Results Among the 12 anal swabs of clinical patients,eight strains ofV?Parahaemolyticus,serum type O3:K6 were isolated from eight anal swabs,and the same eight analswabs were also positive for RT?PCR testing?The RT?PCR confirmed 2 out 18 food samples positive forV?Parahaemolyticus,although culturing method gave negative result for all the food samples?Conclu?sion The RT?PCR method could detect viable but non?culturable V?parahaemolyticus in frozen food andshould be used for pathogen testing for suspect food testing?Key words?Vibrio p arahaemolyticus;Classic culturing;PCR assay;Frozen food;Viable but non?culturable(VBNC)副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐的革兰阴性肠道致病菌,可引起食物中毒、腹泻、胃肠炎、反应性关节炎和心脏疾病。副溶血弧菌广泛分布于自然界,尤其以海产品携带率最高,因此,副溶血弧菌是沿海一带引起食物中毒和急性腹泻的重要病原菌 1。广州地处华南沿海,人们经常食用基金项目:广东省医药卫生科技项目(A2006562)作者单位:广州市疾病预防控制中心,广东广州 510080作者简介:龚玉姣,硕士,博士在读,主管技师,主要从事病原微生物快速检测方法的研究通讯作者:杨智聪,E?mail:gdgzcdc 21cn?com冷冻海鲜产品,因而由副溶血弧菌引发食物中毒出现频率较高。1 材料与方法1?1 材料1?1?1 样本:某学校食物中毒腹泻患者肛拭子 12份,吃后剩余海鲜等食品 18 份。1?1?2 标 准 参 考 株:副 溶 血 弧 菌 标 准 菌 株ATCC33847(TDH 阳性,TRH 阴性)、副溶血弧菌标准菌株 ATCC17802(T DH 阴性,T RH 阳性)、大肠埃希杆菌 AT CC25922 均购自北京菌种检定所。1?1?3 培养基和试剂:氯化钠结晶紫增菌液;嗜盐#988#中国预防医学杂志 2010 年 10 月第 11 卷第 10 期 Chin Prev M ed,October 2010,Vol?11 No?10菌选择性琼脂;T CBS 琼脂;SS 琼脂、3?5%氯化钠三糖铁斜面;嗜盐性生化试验培养基等,均按要求自行配制,并进行高压灭菌;兔血我萋氏培养基、羊血我萋氏培养基购自广东环凯生物公司;血清试剂(日本株式会社);PCR 引物由大连宝生公司合成,T aq酶、10 buffer,MgCl2,dNT Ps 以及 DNA marker均购自大连宝生公司;DNA 提取试剂盒(DneasyTissue 50 次)购自 QIAGEN 公司。1?2 方法1?2?1 副溶血弧菌分离鉴定:按照国家标准 GB4789 对食物中毒采集的样品进行副溶血弧菌的分离培养、生化鉴定和血清学反应以及动物试验 2,分离菌株用 VITEK?120 全自动分析仪复核分析。1?2?2 动物实验:将符合副溶血弧菌生化反应的菌株接种于 3?5%氯化钠胨水中,培养 18 h,用麦氏比浊法调整菌悬液浓度约为 1?0 108细菌/ml,注射于 5 只体重约为 13 15 g 小白鼠腹腔内,每只注射 0?3 ml。同时设立阳性对照组和阴性对照组。阴性对照组小白鼠每只注射无菌的 3?5%氯化钠胨水0?3 ml。阳性对照组的菌悬液用标准副溶血弧菌制备,菌悬液浓度及注射剂量同上。各组小白鼠放于笼内常规饲养,观察 2 3 d。1?2?3 DNA 提取:按照 DNA 提取试剂盒说明书操作(Dneasy T issue Handbook)。1?2?4 PCR 检测:应用一种在种的水平上鉴定副溶血弧菌的 PCR 方法,检测靶标为副溶血弧菌种的特异性基因 toxR 3,副溶血弧菌的耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)4。从GenBank 上获得副溶血弧菌 tdh、trh、toxR 基因的DNA 序列,应用 DNAStar 软件分别设计特异性引物如 下:tdh上 游 引 物 为 5%?CTT CCATCT GT C?CCT TT T?3%,下游引物为 5%?CTGCCATT GT AT?AGT CTT TAT C?3%,扩增片段大小为 243 bp;trh 上游引物5%?ATT GT GGAGGACT AT TGG?3%,下游引物 5%?T TGTGAAGACCGT AGAAG?3%,扩增片段大小为 190 bp;toxR 上游引物为 5%?CAACAAAGCG?GCAACGAA?3%,下 游 引 物5%?CTAAAGACG?GCT CT ACGA?3%,扩增片段大小为 373 bp。PCR 反应体系为 25?l,含 1 buffer、MgCl21?5 mmol/L,dNT Ps 0?2 mmol/L,引物 各 1?mol/L,T aq 酶25 U/ml 及 1?l 模板 DNA。反应程序为:94&预变性 DNA 4 min 后,按 94&30 s,56&45 s,72&60 s 进行 30 个循环,最后 72&延伸 8 min。用含0?5 mg/L 溴化乙啶的 1?5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,通过凝胶成像系统观察结果。2 结果2?1 分离鉴定18 份食物均未分离出副溶血弧菌;12 份患者肛拭子 中 8 份样 本分离出 副溶血弧菌,血 清型为O3 K6,神奈川试验阳性,即菌落均能在兔血我萋氏培养基上生长并产生溶血环,而在羊血我萋氏培养基上生长而不产生溶血环,说明均为耐热直接溶血素(TDH)阳性,相对耐热直接溶血素(TRH)阴性。2?2 生化试验分离菌 株上 仪器 VITEK?120 全自 动分 析仪GNI+卡,系统生化鉴定见表 1,副溶血弧菌符合率为 98%。表 1 分离的副溶血弧菌生化反应结果试验项目结果三氯新葡萄糖氧化阳性生长控制乙酰氨七叶苷植物尿蓝酶尿素枸橼酸盐丙二酸盐苯丙氨酸-+-试验项目结果多粘菌素B 耐药乳糖麦芽糖甘露醇木糖棉子糖山梨醇蔗糖肌醇侧金盏花酵-+-试验项目结果香豆酸H2S?半乳糖苷酶鼠李糖阿拉伯糖葡萄糖发酵精氨酸赖氨酸鸟氨酸氧化酶-+-+2?3 动物实验对小白鼠腹腔注射毒力试验,阴性对照组观察72 h 仍正常;阳性对照组和实验组小白鼠 5 h 后开始发病,竖毛、食欲不振、呼吸困难、四肢抽搐,10 h 内全部死亡。将死亡小白鼠进行解剖检查,发现小肠有出血、水肿,肠黏膜脱落,内有黄色希薄黏液,取肠内容物分离培养鉴定,仍获原注射接种菌,实验结果表明此食物中毒分离的副溶血弧菌具有较强的致病性。2?4 PCR 检测结果副溶血弧菌 TDH 阳性参考株、8 份肛拭子样本和 2份食物 DNA 提取液均扩增出大小为 243 bp tdh基因产物和 373 bp tox R 基因产物,副溶血弧菌TRH 阳性参考株扩增大小为 190 bp trh 基因产物和373 bp toxR 基因产物,而肛拭子和食物样本的 trh#989#中国预防医学杂志 2010 年 10 月第 11卷第 10 期 Chin Prev Med,October 2010,Vol?11 No?10基因扩增结果为阴性;阴性参考菌株大肠杆菌扩增基因结果均为阴性,见图 1。8 份肛拭子样本、2 份食物 DNA 提取液的 tdh 和 toxR 基因片段测序结果与副溶血弧菌 TDH 阳性参考株的 tdh 和 toxR 基因序列的一致性为 100%。注:M,100 bp DNA ladder Marker;1 8,患者肛拭子;9 10,食物;11,副溶血弧菌 T DH 阳性参考株;12,副溶血弧菌 T RH 阳性参考株;13,大肠埃希菌阴性参考株图 1 副溶血弧菌 tdh、trh、tox R 基因 PCR 扩增产物凝胶电泳图谱3 讨 论副溶血弧菌常存在于近海海水、海产品及盐渍食品中,是我国沿海地区夏秋季食物中毒和急性腹泻的主要病原菌,耐热直接溶血素(thermostable directhemolysin,T DH)和相对耐热直接溶血素(T DH?related hemolysin,TRH)被认为是副溶血弧菌的主要毒力因子,与副溶血弧菌的致病能力密切相关 5。在致病力强的副溶血弧菌菌株中存在着一种被称为 神奈川现象!的特殊溶血活性,此现象即是由于编码耐热直接溶血素的基因(tdh)高度表达而产生的 6。引起本次食物中毒的副溶血弧菌,从基因扩增结果可知均为耐热直接溶血素基因阳性而相对耐热直接溶血素基因(trh)阴性,与神奈川试验结果一致,动物试验结果小白鼠均在 10 h 内死亡,并且据流行病学调查,这次食物中毒患者临床表现病情严重,最初表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、洗肉样水便等消化道症状,随后出现发热、头晕、抽筋、肌肉痛,甚至脱水、昏迷等症状,这说明引起这次食物中毒的副溶血弧菌具有较强的致病力。本次食物中毒经 PCR 分析有 2 份海鲜食物副溶血弧菌特异性基因呈阳性,并且 PCR 扩增产物与患者肛拭子以及副溶血弧菌 TDH 阳性参考株都具有同源性,说明本次食物中毒是由该食物引起的,但所有食物经传统分离培养均没有分离出活的副溶血弧菌,也许在经过低温冷冻的海鲜食品中副溶血弧菌转入 活的非可培养(viable but non?cultureable state,VBNC)!状态 7。刘端等 8首次报道了低温、寡营养等环境因子能导致细菌进入 VBNC 状态,研究表明病原微生物进入 VBNC 状态并没有失去致病力,但用常规培养法已无法分离检测出来。本研究用PCR 方法检测冷冻海鲜食品中的副溶血弧菌具有敏感、快速、特异性强等优点,提高了副溶血弧菌的检出率,缩短检出时间,为食物中毒及早诊断和食品安全提供依据。参考文献 1 刘秀梅,陈艳,王晓英,等?1992-2001 年食源性疾病暴发资料分析:国家食源性疾病监测网 J?卫生研究,2004,33(6):725?727?2 中华人民共和国国家标准(食品卫生微生物学检验)GB4789-2003 S?2003?3 Kim YB,Okuda J,M atsumoto C,et al?Identification of Vibrioparahaemolyticus strain at the species level by PCR targeted tothe toxR gene J?J Clin Microbiol,1999,3(7):1173?1177?4 T ada J,Ohashi T,Nishimura N,et al?Detection of the ther?mostable direct hemolysin gene(tdh)and the thermostable di?rect hemolysin?related gene(trh)of Vibrio parahaemolyticus bypolymerase chain reaction J?M ol Cell Probes,1992,6(3):477?487?5 朱雪兰,陈艳?副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展 J?国外医学卫生学分册,2007,34(4):233?236?6 杨振泉,焦新安?副溶血弧菌毒力因子及其致病机理研究进展 J?中国人兽共患病学报,2008,24(11):1070?1073?7郑桂丽,廖绍安,翟俊辉,等?环境中 活的 非可培 养(VBNC)!细菌的研究进展 J?微生学免疫学进展,2004,32(4):58?66?8 刘端?细菌 活的非可培养状态!研究进展 J?疾病监测,1998,9(6):350?354?(收稿日期:2010?07?22)(李川 编辑)#990#中国预防医学杂志 2010 年 10 月第 11 卷第 10 期 Chin Prev M ed,October 2010,Vol?11 No?10