单增李斯特氏菌快速检测方法的建立.pdf

检测分析单增李斯特氏菌快速检测方法的建立刘旸1，张海英1，刘国红1，张宏伟1,2，张霞1,2,*（1.天津出入境检验检疫局，天津 300461；2.天津科技大学，天津 300457）摘要：建立单增李斯特氏菌的快速检测方法。针对单增李斯特氏菌 vir R 基因序列设计特异性引物及探针，建立等温扩增法，并利用免疫金标试纸条对结果进行检测。用 10 株单增李斯特氏菌、6 株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌 24 株进行特异性试验；通过定量 DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证。结果表明建立方法具有较好的特异性；增菌液检测灵敏度为 102cfu/test，DNA 检测灵敏度为 100pg/test。建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高，适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测。关键词：单增李斯特氏菌；快速检测；等温扩增Rapid Detection of Listeria MonocytogenesLIU Yang1,ZHANG Hai-ying1,LIU Guo-hong1,ZHANG Hong-wei1,2,ZHANG Xia1,2,*（1.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300461,China;2.Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China）Abstract：To establish a new rapid method for detection of Listeria monocytogenes.On the basis of sequenceanalysis of the Listeria monocytogenes vir R,specific primers and probe were designed,we developed isothermalamplification method,using the immuno-gold standard test strip to test results.The specificity of the method wasevaluated by 10 strains of Listeria monocytogenes,6 strains of Listeria and 24 strains of foodborne pathogens.The sensitivity of the method was evaluated by testing the quantitative DNA,pure bacteria counted.The methodestablished in this article is specific and sensitive.The limit of decetion is 100pg/test for the genomic DNA,102cfu/test for pure bacterial culture.The method was sensitive,specific.It was suitable for rapid screeningListeria monocytogenes.Key words：Listeria monocytogenes;rapid detection;isothermal amplification基金项目：国家质检总局科研项目（2011IK241）作者简介：刘旸（1978），男（汉），工程师，本科，研究方向：食品安全。*通信作者：张霞（1975），女（汉），高级工程师，硕士研究生，研究方向：食品安全检测。单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）（Lmon）简称单增李斯特氏菌，是一种重要的人兽共患病病原体，感染人和多种动物，引起人和动物脑膜炎、败血症、流产等症状。该菌也是一种最为常见的食源性病原菌，WHO 将其列为 20 世纪 90 年代食品中四大致病菌之一。它在自然界中分布广泛，4 的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，极易污染食品而引起食物中毒和李氏杆菌病的暴发，尤其是在欧美国家经常发生1-3，给人类的健康及畜牧业的生产带来严重的威胁，所以建立快速准确的检测方法是保证食品卫生安全和有效防治本病的重要手段。目前对该菌的检测主要有分离培养方法、免疫学方法4及 PCR 方法5等。分离培养法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要 5 d7 d 完成，不能满足快速检测的要求6，免疫学方法具有操作简单，检测通量大的优点，但是由于该菌与同属异种菌具有交叉抗原，免疫学方法不能进行李斯特氏菌种间特异性鉴定7，而且检测结果容易受多种因素影响，容易出现假阳性，不能满足检测的要求。PCR 方法具有特异性强、灵敏度高等特点，但这类方法通常检测成本高，需要比较昂贵的 PCR 仪，对实验环境和操作者技术要求也比较高，常引起非特异性扩增，扩增反应时间较长,一般需食品研究与开发Food Research And Development2012 年 9 月第 33 卷第 9 期134要几小时,不利于快速检测和基层实验室推广应用。因此，发展新的快速准确、操作简便、成本低廉的检测与鉴定单增李斯特氏菌的方法对于提高食品卫生水平、保证食品安全具有重要的意义。1材料1.1主要材料与试剂dNTPs(Fermentas),10 Bst buffer(New EnglandBiolabs),Bst DNA polymerase large fragment(NewEngland Biolabs),MgSO4(Sigma),betaine(Sigma)，核酸快速检测试纸条（杭州优思达公司）。菌株采用单增李斯特氏菌 10 株，包括 2 株标准菌株、食品中分离出的野生株 8 株及 6 株其他李斯特氏菌属菌株，24 株食源性致病菌详见表 1。1.2主要仪器与设备PCR 扩增仪（Biometra）、离心机（Eppendorf，5417R）、DNA/RNA/蛋 白 分 析 仪（BHIMUZDA，BioSpecmini）。2方法2.1DNA 的提取及定量单增李斯特氏菌 C53-3 为试验菌株，接种于 10 mL营养肉汤中，37 培养 16 h，取 1 mL 用于细菌基因组提取，利用紫外分光光度计检测DNA质量及纯度。2.2引物及探针的设计利用单核细胞增生李斯特氏菌 vir R 基因序列（accession no.DQ449868.1）设计特异性引物及探针为：D1：5 BIOTIN GTCGGTCAATTGCAAAGAG；D2：5 FITC-CTAGCCTGTGCCAAAGCA；D3：5-BIOTIN-TTATCATGCAAGTGCGAAC；CPR：5-GTCGGTCAATTGCAAAGAGACTTGATTAATATATAATTAGCCGTT；F：5-GTACACAGAAAAGCGCTG；R：5-TAGGCAAGTCATCTTGTTC。组成两套扩增体系，第一套扩增体系为 CPR+F+R+D2+D1，第二套扩增体系为 CPR+F+R+D2+D3。2.3反应体系和反应条件反应体系为：10ThermoPol buffer 2 L，10 mmol/LdNTP 0.8 L，100 mmol/L MgSO40.8 L，5 mol/LBetaine 2 L，8 U/L Bst DNA pol 1 L，20 mol/L F/R0.1 L/0.1 L，10 mol/L CPR 0.8 L，20 mol/L D1/D20.8 L/0.8 L，模板 1 L，ddH2O 补足至 50 L。反应条件：61 反应 60 min。2.4结果检测将等温 PCR 扩增产物滴加在核酸快速检测试纸条上，15 min30 min 观察，在质控区出现红色线条，以检测区是否出现红色线条判断反应结果阴阳性。2.5特异性试验及引物筛选对表 1 中菌株核酸样本应用两套引物探针体系进行试验，以筛选一套合适引物及探针，同时证明该体系是否具有通用性及特异性。2.6灵敏度试验以 C53-3 为试验菌株，接种于 10 mL 营养肉汤中，37 培养 16 h。（1）取 1 mL 用于细菌基因组提取，利用紫外分光光度计检测 DNA 质量及纯度，进行DNA 定量灵敏度检测。（2）取 1 mL 做细菌计数，用PBS 对菌液进行 10 倍梯度稀释至 10-8，取 1 mL 提取细菌基因组做实验模板。3结果与分析3.1检测体系的筛选及特异性实验对多株标准菌株、来自各国样品中检测出的阳性野生菌及其他相关阴性菌（见表 1）核酸样本进行试验，进行引物的筛选及特异性实验，以证明检测方法是否具有通用性及特异性。试验结果表明两套体系对于单增李斯特氏菌无论标准株或野生株检测均为阳性，其他 24 株食源性致病菌检测均为阴性，但是在针对李斯特菌属其他菌种检测时具有差别，第一套体系特异性良好，只在西尔表 1试验菌株Table 1Bacterial strains for detection菌名来源菌号菌名来源菌号单增李斯特氏菌 CMCC53-3蜂房哈夫尼亚菌CMCC45201单增李斯特氏菌 CMCC53-4弗劳地枸橼酸杆菌CMCC48021单增李斯特氏菌 样品L.mon6801产酸克雷伯氏菌ATCC49334单增李斯特氏菌 样品L.mon7718肺炎克雷伯氏菌CMCC46114单增李斯特氏菌 样品L.mon7831鼻硬结克氏杆菌CMCC46116单增李斯特氏菌 样品L.mon7918聚团肠杆菌样品 entagg5624单增李斯特氏菌 样品L.mon8826鲍氏志贺菌CMCC51250单增李斯特氏菌 样品L.mon9908阴沟肠杆菌样品 E.clo6929-1单增李斯特氏菌 样品L.mon6830中间肠杆菌样品 E.int51231单增李斯特氏菌 样品L.mon1916假结核耶尔森氏菌CMCC53501格氏李斯特氏菌 ATCC700545小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52301绵羊李斯特氏菌 ATCCBAA-139肠炎沙门氏菌CMCC50041威尔李斯特氏菌 ATCC35897普通变形杆菌CMCC49027西尔李斯特氏菌 ATCC35967奇异变形杆菌CMCC49005无害李斯特氏菌 ATCC33090阴沟肠杆菌CMCC45301无害李斯特氏菌 样品L.inn7217产气肠杆菌CMCC45103阪崎肠杆菌ATCC12868液化沙雷氏菌样品Serliq5123伤寒沙门菌CMCC50096大肠杆菌 O157：H7样品PTS001大肠杆菌CMCC43046粘质沙雷氏菌ATCC13880绿脓杆菌样品pesaer6310气味沙雷氏菌ATCC33077检测分析刘旸，等：单增李斯特氏菌快速检测方法的建立135李斯特菌检测出现假阳性，而第二套体系特异性较差，在威尔李斯特氏菌及绵羊李斯特氏菌检测均为假阳性。所以后续灵敏度试验均采用第一套引物检测体系。3.2灵敏度检测3.2.1DNA 检测灵敏度利用紫外分光光度计检测 C53-3 DNA 纯度为1.672，质量 34.08 g/mL。用 TE 对 DNA 原液进行 10 倍梯度稀释至 10-6，按照反应体系进行试验，如图 1 所示，当 DNA 稀释 10-1至 10-4即浓度至 3.4 pg/L 时检测为阳性，在检测区可见红色条带；稀释至 10-5至 10-6更低稀释浓度时，检测结果为阴性，在检测区无条带显示，说明该方法 DNA 检测灵敏度可达到 100pg/test。3.2.2纯菌液灵敏度检测C53-3 过夜菌液计数为 5.4108CFU/mL，用 PBS对菌液进行 10 倍梯度稀释至 10-8即 5.4100CFU/mL，各取 1 mL 提取细菌基因组做实验模板，检测灵敏度结果见图 2，10-1至 10-5稀释时，结果为阳性，在检测区可见红色条带；稀释至 10-6至 10-8稀释时检测结果为阴性，在检测区无条带显示，说明该方法菌液检测灵敏度达到 102CFU/test。4结论与传统检测手段相比，分子生物学检测技术能更快，更可靠发现食品安全隐患，尤其是目前得到广泛应用的等温扩增方法将检测提高到一个新的高度，很好地解决了目前基因检测对仪器的依赖，使得分子生物学方法在基层及偏远经济不发达地区得到广泛使用。本研究建立的单增李斯特氏菌恒温扩增方法较环介导等温扩增方法（LAMP）在检测结果方面有了很好的改善。LAMP 如果使用电泳来观察，存在交叉污染的可能；如果采用肉眼观察沉淀或颜色变化，那么阳性结果标准不能客观地界定。本研究建立的方法结合核酸快速检测试纸条进行检测，依据试纸条上检测线的有无可以明确判定阴阳性结果，其检测 DNA 灵敏度可达到 100pg/test、纯菌液灵敏度达到 102CFU/test 可满足样品增菌后的检测需求。虽然本方法在李斯特菌属检测中存在西尔李斯特氏菌检测假阳性问题，但较免疫金标试纸条检测只能检测到李斯特氏菌属的特异性上已经有了很大程度的提高。结合实际样品检测结果表明，该方法灵敏度较高，无漏检现象，操作简便，不需要特殊设备，特别适合于基层实验室检测以及样品的快速筛选检测。参考文献：1MacDonald P D,Whitwam R E,Boggs J D,et al.Outbreak ofListeriosis among Mexican immigrants as a result of consumption ofillicitly produced Mexican-style cheeseJ.Clin Infect Dis,2005,40(5):677-6822Gottlieb S L,Newbem E C,Grifin P M.Multistate outbreak 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quantifying template DNAJ.Biochem Biophys Methods,2004,59:145-157收稿日期：2012-02-21N 为空白对照；P 为阳性对照；Lane1Lane8,10-110-8菌液稀释。对照区检测区NP12345678图 2单增李斯特氏菌液灵敏度试验Fig.2Sensitivity of detecting L.mon in pure culture对照区检测区NP123456N 为空白对照；P 为阳性对照；Lane 1Lane 6 为 10-110-6DNA稀释液。图 1单增李斯特氏菌 DNA 灵敏度试验Fig.1Sensitivity of detecting DNA of L.mon检测分析刘旸，等：单增李斯特氏菌快速检测方法的建立136