几种抗氧化剂对羟自由基的体外清除作用.pdf

第 24 卷 第 2期2002 年 6 月湘潭师范学院学报(自然科学版)Journal of Xiangtan Normal University(Natural Science Edition)Vol.24 No.2June 2002几种抗氧化剂对羟自由基的体外清除作用 王海华,蒋明义,汪 琼,吴 琼(湘潭师范学院 生命科学系,湖南 湘潭 411201)摘要:以 Fenton 反应系统作为羟自由基(OH)源,以二甲亚矾为探针,用分光光度计法测定并比较了四种抗氧化剂 维生素 C(Vc)、dl-生育酚、l-还原型谷胱甘肽(l-GSH)、l-半胱氨酸(l-Cys)对OH的清除作用。关键词:抗氧化剂;羟自由基;体外清除作用;Fenton 反应;比色法中图分类号:O945文献标识码:A文章编号:1671-0231(2002)02-0087-04生物抗氧化剂的研究近年来已引起广泛关注,许多小分子生物抗氧化剂如维生素 C(Vc)、-生育酚、-类胡萝卜素、还原型谷胱甘肽(GSH)等可以通过清除体内产生的氧自由基,切断过氧化链反应,从而抑制脂质过氧化,使机体免遭氧化损伤。然而,由于抗氧化剂种类繁多,结构复杂,作用专一性不强,所处微观环境及自由基产生和引发差异,自由基检测手段不完善等原因,人们对其抗氧化机理并不十分清楚。生物体内氧自由基通过酶促反应、膜电子传递泄露、自动氧化不断产生,包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH)和单线态氧(1O2)等,其中羟自由基的反应活性最强。目前,有关生物抗氧化剂清除OH 的资料多来源于间接测定(如OH 作用下的水杨酸羟基化速率的抑制 1)、电子顺磁共振(ESR)法 2、高效液相色谱(HPLC)法 3和化学发光法 4,用比色法测定的甚少;同时,由于各个研究者检测的条件不一致,所得到的结果也不尽相同,甚至迥异。本文以 Fenton 试剂作为OH 源,以二甲亚砜为探针,测定和比较了维生素 C、dl-生育酚、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸(l-Cys)对OH 的清除作用。本实验原理为:Fe2+H2O2 Fe3+OH-+OHCH3SOCH3+OH CH3SOOH+CH3CH3SOOH+Ar-N=N+Ar-NN-SO2-CH3+H+1 材料和方法1.1 试剂维生素 C(湖南师大化学试剂厂,分析纯),l-GSH、l-Cys(上海伯奥,生化试剂),dl-87 收稿日期:2002-01-30基金项目:湖南省教委重点课题(97A15)作者简介:王海华(1969-),男,湖南湘乡人,硕士,讲师,研究方向:植物生理生化.生育酚(E.Merck,生化试剂),其余试剂均为国产分析纯。1.2 羟自由基的产生按徐向荣等 5的方法。具体为:在10 ml 刻度试管中,加入 2ml 200 mmol/L 二甲亚砜,1ml0.1 mol/L HCl,2.5 ml 18 mol/L H2O2启动反应,加重蒸水补充至刻度,混匀。1.3 羟自由基的测定与清除率的测定按徐向荣等 5的方法。dl-生育酚以少许无水乙醇溶解,其余用重蒸水溶解,分别加入到 1.2 体系至所需浓度,测定羟自由基清除率。2 结果与分析2.1 Vc、-生育酚对OH 的清除作用在所检测的整个浓度范围内,-生育酚对OH 的清除率随着浓度的升高而上升,在 0.1mmol/L 时,清除反应体系中 47.6%的OH,而 Vc 在 0.01-0.10 mmol/L 浓度范围内,其清除曲线的变化趋势与 -生育酚的基本一致,但随着浓度的升高,清除率有所下降,到 0.1 mmol/L时清除率为50.0%(图 1)。从图上还可看出,Vc 清除OH 的能力比 -生育酚强。2.2 l-GSH、l-Cys对OH 的清除作用图2 表明,两种抗氧化剂对OH 的清除效果与所用浓度成正相关性,即浓度越大,清除效果越佳。在低浓度范围内(0.01-0.08 mmol/L),两者清除OH 的能力相当,但在总体上,l-GSH 对OH 的清除作用明显强于 l-Cys,尤其当浓度达 0.10 mmol/L,前者对OH 清除率明显大于后者。有趣的是,l-Cys在 0.01 mmol/L 时的清除率是 l-GSH 的 1.23 倍,在 0.02-0.08mmol/L 浓度范围内清除作用曲线稳步上升,而 l-GSH 上升却十分平缓。资料表明,l-GSH在较低浓度且与 Fe2+、H2O2共存的情况下,可以产生OH。因此在低浓度下 l-GSH 清除OH的作用受到削弱,变化相对平缓;而超过一定浓度值,l-GSH 与 Fe2+、H2O2共存可能不会产88生OH,此时对OH 清除作用更加明显。本实验中,l-GSH 从 0.08 mmol/L 到 0.10 mmol/L,清除率陡然上升到 71.4%。3 讨论在需氧生物代谢过程中会不可避免地产生氧自由基。而各种氧自由基中,OH 是已知的最强的氧化剂,它几乎可以和所有的细胞成份发生反应,引起膜脂、蛋白质和核酸氧化损伤、导致细胞衰老、死亡、机体病变。因此OH 的检测及探讨抗氧化分子对OH 的清除,对自由基生物学的研究是有一定的意义。前已所述,OH 的检测有 ESR,HPLC 法、化学发光法。这些方法虽然直接、有效(如 ESR)、灵敏、快捷(如化学发光法),但多需要昂贵的仪器,操作也较为复杂(如 ESR、HPLC),所用试剂不易得到,难以普遍应用。本实验运用比色法研究了几种抗氧化剂对OH 的清除作用,证明准确可靠。该方法可用于OH 清除剂的筛选和OH 清除机理的研究。Vc 是已知的OH 清除剂,徐向荣等 5 用它来验证比色法测定OH 的可行性,表明在一定浓度范围内OH 的清除率与Vc 浓度有明显的量效关系。我们的结果与其基本一致,所不同的是,在 0.08-0.10 mmol/L 时,Vc 清除OH 的效果有所下降。在 Fenton 反应体系中,Vc 一方面可以清除OH,本身转变为脱氢抗坏血酸;另一方面,其将 Fe3+还原成 Fe2+的同时产生 O2-、H2O2和OH 6,7,生成的 Fe2+与H2O2发生Fenton 反应又产生OH,因此其对OH 的清除取决于这两方面因素影响。可能在相对较高浓度下,由于铁离子存在,产生OH 的方面有所增强,才导致上述结果。清除反应体系中 50.0%的OH 时,Vc、l-GSH、l-Cys的浓度分别约为 0.04、0.085、0.095mmol/L,-生育酚要达到 0.10 mmol/L 以上才可能达到 50%的清除效果,表明四种抗氧化剂清除OH 的能力顺序为Vcl-GSHl-Cys-生育酚。89参考文献:1 Smirnoff N,Cumbes Q J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes J.Phytochem,1989,28(4):1057-1060.2 Stokes N J,Tabner B J,Hewitt C N.Determination of hydroxyl radical concentrations in environmental chambers usingelectron spin resonance J.Chemosphere,1994,28(5):999-1008.3 Kaur H,Halliwell B.Aromatic hydroxylation of phenylanine as an assay for hydroxyl radicals J.Anal Biochem,1994,220(1):11-15.4 陈季武,胡天喜.测定OH 产生与清除的化学发光体系 J.生物化学与生物物理进展,1992,19(2):136-140.5 徐向荣,王文华,李华斌.比色法测定 Fenton反应产生的羟自由基及其应用 J.生物化学与生物物理学报,1999,26(1):67-69.6 赵保路.氧自由基和天然抗氧化剂 M.北京:科学出版社,1999.7 于颖彦,冈田茂.不同浓度维生素 C对亚油酸微团的促过氧化和抗过氧化作用 J.生物化学与生物物理学报,1996,28(1):101-105.Hydroxyl radical scavenging effects in vitroby several antioxidantsWANG Hai-hua,JIANG Ming-yi,WANG Qiong,WU Qiong(Department of Life Science,Xiangtan Normal University Xiangtan 411201,China)Abstract:The scavenging effects of hydroxyl radicals,which were produced by Fenton reaction,by4 kinds of antioxidants were assayed invitro by colorimetry with dimethyl sulfoxide as a probe.These an-tioxidants included vitamin C(Vc),dl-topopherol,l-GSH and l-cystein.Key words:Antioxidant;hydroxyl radical;effect of scavenging in vitro;Fenton reaction;colorime-try90