产单核细胞李斯特菌的ＰＦＧＥ分子分型分析.pdf

收稿日期：作者简介：颜卫（），女，讲师，硕士。产单核细胞李斯特菌的 分子分型分析颜卫，焦新安，潘志明，黄金林，殷月兰（江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏 泰州 ；扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 ）摘要：对 株不同来源的产单核细胞李斯特菌（）进行 分型，比较食源、环境、人源菌株之间的相似性。结果显示，同一市场内，环境污水分离株和新鲜食品分离株表现出较高同源性，新鲜食品分离株与即食性（）食品分离株相似性很高，临床脑膜炎病人的株 与 食品分离株在进化上显示出了很近的亲缘关系。株 的分子分型分析提示了菌株从市场环境污水新鲜食品 食品人的传播模式，为食源性疾病溯源追踪提供了新的思路。关键词：产单核细胞李斯特菌；脉冲场凝胶电泳；分子分型中图分类号：；文献标志码：文章编号：（），（，；，）：（）（），：；产单核细胞李斯特菌（，）是一类兼性胞内生长、革兰阳性细菌。能引起食源性疾病，也可引发脑炎、脑膜脑炎、流产以及免疫缺陷病人和新生儿的中枢神经系统的感染。很多基于基因结构的分型方法，如随机扩增多态性（）、核糖体分型（）、扩增片段长度多态性（）和脉冲场凝胶电泳（）都已被用于细菌的基因分型。在这些方法中，和 显 示出 具有 较高区 分 菌 株的 能力，的主要缺点是其稳定性和重复性不够好，而 的敏感性较强，被认为是分子分析的金标准。因此，本研究比较分析了 株分离自食品、环境及临床 分离株的 分型结果，构建了菌株的系统发生树，以探讨 作为 分子分型及遗传谱系分析的可能性，及用于食源性疾病溯源的可行性。材料与方法 菌株来源及培养所用 株 包括分离自扬州市四大农贸市场新鲜猪肉、鱼、豆制品、蔬菜、即食性食品、市场环境污水的菌株，分离自药业生产基地和种羊场健康羊群的菌株以及来源于南京军区总医院病人脑脊液的菌株，均为扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室保存。背景资料详见表。细菌培养细菌在 培养基 过夜培养，调整 ，菌液与溶菌酶（）以混匀后于 孵育。制备全基因组 菌液与琼脂糖混合制取包埋块，中 放置。加入含 蛋白酶和十二烷基肌氨酸钠的 孵育包块中 国 兽 医 学 报 年月第 卷第期 表试验用 株 的背景资料编号菌株号来源分离地血清型 组合型编号菌株号来源分离地血清型 组合型（）猪肉市场 污水市场 熟鹅肉市场 熟猪肝市场 （）熟鸡腿市场 污水市场 熟鸡腿市场 猪肉市场 熟牛肉市场 猪肉市场 熟鸡腿市场 鱼类市场 蔬菜市场 鱼类市场 猪肉市场 鱼类市场 鱼类市场 熟鹅肉市场 脑脊液医院 污水市场 脑脊液医院 羊鼻腔基地 污水市场 熟鸡肉市场 鱼类市场 羊鼻腔种羊场 熟牛肉市场 环境种羊场 豆制品市场 环境种羊场 污水市场 环境种羊场 猪肉市场 环境种羊场 猪肉市场 环境种羊场 蔬菜市场 环境种羊场 熟猪肝市场 羊鼻腔基地 鱼类市场 猪舌头市场 ；更换新鲜同配方 孵育；预热的超纯水和 分别清洗包块各次；含 的 温育包块 ，超纯水和 各清洗次。酶切包块 保存或酶切。切割成 小块放入倍 中，孵育 。加 酶复合物，冰水浴 ，转移至 酶切。电泳制脉冲场电泳用凝胶。加入 ，设定温度，蠕动泵数值为。酶切后小块加入上样孔。设定电泳参数：场强 ，电场夹角 ，温度，电场转换时间 ，电泳时间。电泳结束后，染色 ，蒸馏水进行脱色，拍摄图像。图象分析及结果距阵应用 软件绘制菌株的系统发生树，完成相似性距阵分析。结果 株 的 结果见图 。泳道编号对应于表列出的菌株编号。图谱显示每株 均产生了 条电泳带，条带数量适中，清晰易读。所有 消化片段的图谱样式均为 所特有。图 号 菌株的脉冲图谱 ；下图同 株 遗传进化树从图可知，基于 的分子分型分析方法将 株 分为个遗传谱系 和 。其中 株属于 中 国 兽 医 学 报 年月第 卷第期 图 号 菌株的脉冲图谱，株属于 ，株李斯特脑膜炎分离株 （编号）和 （编号）分属于谱系和谱系。谱系菌株又可分为个亚群 和，其中 株属于，株属于。除 、和 外，所有分离自新鲜食品的 均属于谱系，分离自即食性（）食品的 分布于谱系和谱系，其中株属于谱系，株属于谱系。图 号 菌株的脉冲图谱图 株 的遗传进化树 株 的相似性距阵分析相似性距阵显示，同一市场 食品分离株 （编号）和 （编号）同源性最高，相似性系数达到 。其 次 为临 床脑膜 炎 病 人分离 株 （编 号 ）与 市 场 食 品 分 离 株 （编号），相似性系数 。同一市场新鲜食品分离株 （编号）和市场内环境污水分离株 （编号）相似性为 。同一市场新鲜食品分离株 （编号）和 （编号）、（编号）及和 （编号）的相似性为 和 。同源性最低的为标准菌 和羊场环境分离株 ，相似性仅为 。讨论 株 的 分析结果表明，同一市场 食品与新鲜食品分离株相似性很高，表明同一市场同类食品之间存在 交叉污染的隐患。同一市场新鲜食品分离株和市场内环境污水分离株表现出较高同源性，提示了市场内 从环境污水到新鲜食品的传播和污染模式。值得注意的是，临床脑膜炎病人的株 与市场 食品分离株在进化上显示出了很近的亲缘关系，说明食品中的致病菌很可能引起人类疾病，提示关注食品安全问题，加强食品安全措施制定的重要性。分析通过比较菌株基因组确定菌株间的亲缘关系，适用于食源中 国 兽 医 学 报 年月第 卷第期 性疾病的溯源追踪。此外，的分型结果可以协助临床发现潜在的危险因素，及时切断流行菌株的来源及传播途径。和 都是基于分子的分型方法，本研究也比较了 谱与 谱在流行病学上的价值。结果表明，型相同的菌株例如临床脑膜炎病人分 离株 与 食 品分离 株 ，临床分离株 与 食品分离株 ，同 一 市 场 食 品 分 离 株 与生食样品分离株 ，同一市场 食品分离株 与环境污水分离株 ，具有相同的 组合型和血清型，但 相似性分别只有 ，每对菌株之间不同的条带超条。依据 等提出的一套 条带判读标准：有条以上条带区别，说明细菌之间存在个以上基因的不同，那么被测细菌种系无相关。这就进一步证明 较血清分型、等分型方法有更好的区分能力，可以反映更多的差异信息量。、以及血清分型结果的比较，显示了 分型方法高分辨力和高灵敏度的特点，突出了其作为细菌亚分型“金标准”的优势。此外，本研究选用的 株 有些分离的时间相同，有些分离的时间不同，最终获得的脉冲图谱显示，菌株采集的时间和 分型结果没有任何相关，在同一年份甚至同一天分离的 均出现了不同的限制性酶切图谱。另外，从相似性系数看，株 中没有出现 同源的菌株，试验菌株都比较分散，这就提示了中国部分地区并没有绝对的 流行株。综上所述，分型方法为实验室开展包括 在内的病源菌流行病学调查研究提供了有利工具，可以帮助确认不同来源菌株间的亲缘关系以及相关性，为食源性疾病溯源搭建了很好的技术平台。参考文献：，：，：，：詹銮峰，严延生，郭维植，等脉冲场凝胶电泳用于霍乱弧菌分子流行病学研究中国卫生检验杂志，：，：，：李燕俊，赵熙，杨宝兰，等 肠炎沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分型研究 卫生研究，：中 国 兽 医 学 报 年月第 卷第期