保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则(2020年版）.doc

保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则（2020年版）1 依据本指导原则依据食品安全国家标准GB 15193系列标准制定。2 范围本指导原则适用于保健食品及其原料的安全性毒理学的检验与评价。3 受试物3.1 受试物为保健食品或保健食品原料。3.2 资料要求3.2.1 应提供受试物的名称、性状、规格、批号、生产日期、保质期、保存条件、申请单位名称、生产企业名称、配方、生产工艺、质量标准、保健功能以及推荐摄入量等信息。3.2.2 受试物为保健食品原料时，应提供动物和植物类原料的产地和食用部位、微生物类原料的分类学地位和生物学特征、食用条件和方式、食用历史、食用人群等基本信息，以及其他有助于开展安全性评估的相关资料。3.2.3 原料为从动物、植物、微生物中分离的成分时，还需提供该成分的含量、理化特性和化学结构等资料。3.2.4 提供受试物的主要成分、功效成分/标志性成分及可能含有的有害成分的分析报告。3.3 受试物的特殊要求3.3.1 保健食品应提供包装完整的定型产品。毒理学试验所用样品批号应与功能学试验所用样品批号一致，并且为卫生学试验所用三批样品之一（益生菌、奶制品等产品保质期短于整个试验周期的产品除外）。根据技术审评意见要求补做试验的，若原批号样品已过保质期，可使用新批号的样品开展试验，但应提供新批号样品按产品技术要求检验的全项目检验报告。3.3.2 由于推荐量较大等原因不适合直接以定型产品进行试验时，可以对送检样品适当处理，如浓缩等。为满足安全倍数要求，可去除部分至全部辅料，如去除辅料后仍未达到安全倍数要求，可部分去除已知安全的食品成分等。应提供受试样品处理过程的说明和相应的证明文件，处理过程应与原保健食品的主要生产工艺步骤保持一致。4 毒理学试验的主要项目依据食品安全国家标准GB 15193的相关评价程序和方法开展下列试验。4.1 急性经口毒性试验4.2 遗传毒性试验：细菌回复突变试验，哺乳动物红细胞微核试验，哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验，小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验，体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验，体外哺乳类细胞TK基因突变试验，体外哺乳类细胞染色体畸变试验，啮齿类动物显性致死试验，体外哺乳类细胞DNA损伤修复（非程序性DNA合成）试验，果蝇伴性隐性致死试验。遗传毒性试验组合：一般应遵循原核细胞与真核细胞、体内试验与体外试验相结合的原则，并包括不同的终点（诱导基因突变、染色体结构和数量变化），推荐下列遗传毒性试验组合：组合一：细菌回复突变试验；哺乳动物红细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验或啮齿类动物显性致死试验。组合二：细菌回复突变试验；哺乳动物红细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；体外哺乳类细胞染色体畸变试验或体外哺乳类细胞TK基因突变试验。根据受试物的特点也可用其他体外或体内测试替代推荐组合中的一个或多个体外或体内测试。4.3 28天经口毒性试验4.4 致畸试验4.5 90天经口毒性试验4.6 生殖毒性试验4.7 毒物动力学试验4.8 慢性毒性试验4.9 致癌试验4.10 慢性毒性和致癌合并试验5 毒性试验的选择5.1 保健食品原料需要开展安全性毒理学检验与评价的保健食品原料，其试验的选择应参照新食品原料毒理学评价有关要求进行。5.2 保健食品5.2.1 保健食品一般应进行急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验和28天经口毒性试验。根据实验结果和目标人群决定是否增加90天经口毒性试验、致畸试验和生殖毒性试验、慢性毒性和致癌试验及毒物动力学试验。5.2.2 以普通食品为原料，仅采用物理粉碎或水提等传统工艺生产、食用方法与传统食用方法相同，且原料推荐食用量为常规用量或符合国家相关食品用量规定的保健食品，原则上可不开展毒性试验。5.2.3 采用导致物质基础发生重大改变等非传统工艺生产的保健食品，应进行急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验、90天经口毒性试验和致畸试验，必要时开展其他毒性试验。6 特定产品的毒理学设计要求6.1 针对产品配方中含有人体必需营养素或已知存在安全问题的物质的产品，如某一过量摄入易产生安全性问题的人体必需营养素（如维生素A、硒等）或已知存在安全问题物质（如咖啡因等），在按其推荐量设计试验剂量时，如该物质的剂量达到已知的毒性作用剂量，在原有剂量设计的基础上，应考虑增设去除该物质或降低该物质剂量（如降至未观察到有害作用剂量）的受试物剂量组，以便对受试物中其他成分的毒性作用及该物质与其他成分的联合毒性作用做出评价。6.2 推荐量较大的含乙醇的受试物，在按其推荐量设计试验剂量时，如超过动物最大灌胃容量，可以进行浓缩。乙醇浓度低于15（V/V）的受试物，浓缩后应将乙醇恢复至受试物定型产品原来的浓度。乙醇浓度高于15的受试物，浓缩后应将乙醇浓度调整至15，并将各剂量组的乙醇浓度调整一致。不需要浓缩的受试物，其乙醇浓度高于15时，应将各剂量组的乙醇浓度调整至15。在调整受试物的乙醇浓度时，原则上应使用生产该受试物的酒基。6.3 针对适宜人群包括孕妇、乳母或儿童的产品，应特别关注是否存在生殖毒性和发育毒性，必要时还需检测某些神经毒性和免疫毒性指标。6.4 有特殊规定的保健食品，应按相关规定增加相应的试验，如含有益生菌、真菌等，应当按照保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则开展相关试验。7 动物实验设计共性问题7.1 受试物的前处理7.1.1 袋泡茶类受试物的提取方法应与产品推荐饮用的方法相同，可用该受试物的水提取物进行试验。如果产品无特殊推荐饮用方法，水提取物可采用以下提取条件进行：常压、温度8090，浸泡时间30 min，水量为受试物质量的10倍或以上，提取2次，将提取液合并浓缩至所需浓度，并标明该浓缩液与原料的比例关系。如产品有特殊推荐服用方法（如推荐食用浸泡后的产品），在毒理学试验设计时应予以考虑。7.1.2 液体受试物需要进行浓缩处理时，应采用不破坏其中有效成分的方法。可使用温度6070 减压或常压蒸发浓缩、冷冻干燥等方法。液体受试物经浓缩后达到人体推荐量的试验要求，如不能通过灌胃给予的，容许以掺入饲料的方式给予实验动物。 7.1.3 不易粉碎的固体受试物（如蜜饯类和含胶基的受试物）可采用冷冻干燥后粉碎的方式处理，并在试验报告中详细说明。7.1.4 含益生菌或其他微生物的受试物在进行细菌回复突变试验或体外细胞试验时，应将微生物灭活，并说明具体方法。7.1.5 对人体推荐量较大的受试物，在按其推荐量设计试验剂量时，如超过动物的最大灌胃容量或超过掺入饲料中的限量（10（w/w），可允许去除无安全问题的部分至全部辅料或已知安全的食品成分进行试验，并在试验报告中详细说明。7.1.6 吸水膨胀率较高的受试物应考虑受试物吸水膨胀后对给予剂量和实验动物的影响，应选择合适的受试物给予方式（灌胃或掺入饲料）。如采用灌胃方式给予，应选择水为溶媒。7.2 受试物的给予方式7.2.1 受试物应经口给予。根据受试物的性质及人体推荐摄入量，选择掺入饲料或饮水、灌胃的方式给予受试物。应详细说明受试物配制方法、给予方法和时间。7.2.2 灌胃给予受试物时，应根据试验的特点和受试物的理化性质选择适合的溶媒（溶剂、助悬剂或乳化剂），将受试物溶解或悬浮于溶媒中。溶媒一般可选用蒸馏水、纯净水、食用植物油、食用淀粉、明胶、羧甲基纤维素、蔗糖脂肪酸酯等，如使用其他溶媒应说明理由。所选用的溶媒本身应不产生毒性作用；与受试物各成分之间不发生化学反应，且保持其稳定性；无特殊刺激性或气味。7.2.3 掺入饲料或饮水方式给予受试物时，应保证受试物的稳定性、均一性及适口性，以不影响动物摄食、饮水量和营养均衡为原则。当受试物在饲料中的加入量超过5（w/w）时，需考虑动物的营养需要，结合受试物的蛋白质含量将各组饲料蛋白质水平调整一致，并说明具体调整方法。饲料中添加受试物的比例最高不超过10（w/w）。7.3 实验动物的选择实验动物应符合相应国家标准的要求，同时结合保健功能（如辅助改善记忆、缓解体力疲劳等）的特点选择适当的实验动物的品系、性别和年龄等。8 试验结果的判定与应用8.1 急性毒性试验8.1.1 原料 如LD50小于人的推荐（可能）摄入量的100倍，则一般应放弃该受试物作为保健食品原料，不再继续进行其他毒理学试验。8.1.2 保健食品8.1.2.1 如LD50小于人的可能摄入量的100倍，则放弃该受试物作为保健食品。如LD50大于或等于100倍者，则可考虑进入下一阶段毒理学试验。8.1.2.2 如动物未出现死亡的剂量大于或等于10g/kgBW（涵盖人体推荐量的100倍），则可进入下一阶段毒理学试验。8.1.2.3 对人的可能摄入量较大和其它一些特殊原料的保健食品，按最大耐受量法给予最大剂量动物未出现死亡，也可进入下一阶段毒理学试验。8.2 遗传毒性试验8.2.1 如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验。8.2.2 如遗传毒性试验组合中两项或以上试验阳性，则表示该受试物很可能具有遗传毒性和致癌作用，一般应放弃该受试物应用于保健食品。8.2.3 如遗传毒性试验组合中一项试验为阳性，根据其遗传毒性终点、结合受试物的结构分析、化学反应性、生物利用度、代谢动力学、靶器官等资料综合分析，再选两项备选试验（至少一项为体内试验）。如再选的试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验；如其中有一项试验阳性，则应放弃该受试物应用于保健食品。8.3 28天经口毒性试验对只需要进行急性毒性、遗传毒性和28天经口毒性试验的受试物，若试验未发现有明显毒性作用，综合其他各项试验结果可做出初步评价；若试验发现有明显毒性作用，尤其是存在剂量-反应关系时，应放弃该受试物用于保健食品。8.4 90天经口毒性试验根据试验所得的未观察到有害作用剂量进行评价，原则是：a)未观察到有害作用剂量小于或等于人的推荐（可能）摄入量的100倍表示毒性较强，应放弃该受试物用于保健食品。b)未观察到有害作用剂量大于100倍而小于300倍者，应进行慢性毒性试验。c)未观察到有害作用剂量大于或等于300倍者则不必进行慢性毒性试验，可进行安全性评价。8.5 致畸试验根据试验结果评价受试物是否为该实验动物的致畸物。若致畸试验结果阳性则不再继续进行生殖毒性试验和生殖发育毒性试验。在致畸试验中观察到的其他发育毒性，应结合28天和（或）90天经口毒性试验结果进行评价，必要时进行生殖毒性试验和生殖发育毒性试验。8.6 生殖毒性试验和生殖发育毒性试验根据试验所得的未观察到有害作用剂量进行评价，原则是：a)未观察到有害作用剂量小于或等于人的推荐（可能）摄入量的100倍表示毒性较强，应放弃该受试物用于保健食品。b)未观察到有害作用剂量大于100倍而小于300倍者，应进行慢性毒性试验。c)未观察到有害作用剂量大于或等于300倍者则不必进行慢性毒性试验，可进行安全性评价。8.7 慢性毒性和致癌试验8.7.1 根据慢性毒性试验所得的未观察到有害作用剂量进行评价的原则是：a)未观察到有害作用剂量小于或等于人的推荐（可能）摄入量的50倍者，表示毒性较强，应放弃该受试物用于保健食品。b)未观察到有害作用剂量大于50倍而小于100倍者，经安全性评价后，决定该受试物可否用于保健食品。c)未观察到有害作用剂量大于或等于100倍者，则可考虑允许使用于保健食品。 8.7.2 根据致癌试验所得的肿瘤发生率、潜伏期和多发性等进行致癌试验结果判定的原则是（凡符合下列情况之一，可认为致癌试验结果阳性。若存在剂量-反应关系，则判断阳性更可靠）：a)肿瘤只发生在试验组动物，对照组中无肿瘤发生。b)试验组与对照组动物均发生肿瘤，但试验组发生率高。c)试验组动物中多发性肿瘤明显，对照组中无多发性肿瘤，或只是少数动物有多发性肿瘤。d)试验组与对照组动物肿瘤发生率虽无明显差异，但试验组中发生时间较早。致癌试验结果阳性应放弃将该受试物用于保健食品。9 安全性综合评价时需要考虑的因素9.1 试验指标的统计学意义、生物学意义和毒理学意义对实验中某些指标的异常改变，应根据试验组与对照组指标是否有统计学差异、是否存在剂量-反应关系、同类指标结果的一致性、不同性别结果的一致性、与受试物声称的保健功能的关联以及本实验室的历史性对照值范围等，综合考虑指标差异有无生物学意义，并进一步判断是否具有毒理学意义。此外，如在受试物组发现某种在对照组没有发生的肿瘤，即使与对照组比较无统计学意义，仍要给予关注。9.2 人体推荐（可能）摄入量较大的受试物一方面，若受试物掺入饲料的最大加入量（原则上最高不超过饲料的10）或液体受试物经浓缩后仍达不到未观察到有害作用剂量为人体推荐（可能）摄入量的规定倍数时，综合其他毒性试验结果和实际人体食用或饮用量进行安全性评价。另一方面，应考虑给予受试物量过大时，可能通过影响营养素摄入量及其生物利用率，从而导致某些与受试物无关的毒理学表现。9.3 时间-毒性效应关系对由受试物引起实验动物的毒性效应进行分析评价时，要考虑在同一剂量水平下毒性效应随时间的变化情况。9.4 人群资料由于存在着动物与人之间的物种差异，在评价保健食品及其原料的安全性时，应尽可能收集人群接触受试物后的反应资料。人体的毒物动力学或代谢资料对于将动物试验结果推论到人体具有很重要的参考意义。9.5 动物毒性试验和体外试验资料本程序所列的各项动物毒性试验和体外试验系统是根据目前管理（法规）毒理学规定所得到的重要资料，也是进行安全性评价的主要依据。结合其他来源于计算毒理学、体外试验或体内试验的相关资料，有助于更加全面地解释实验结果，做出科学的评价。9.6 不确定系数即安全系数。将动物毒性试验结果外推到人时，鉴于动物与人的物种和个体之间的生物学差异，不确定系数通常为100，但可根据受试物的原料来源、理化性质、毒性大小、代谢特点、蓄积性、接触的人群范围、保健食品及其原料中的使用量和人的可能摄入量、使用范围及功能等因素来综合确定其安全系数的大小。9.7 毒物动力学试验的资料毒物动力学试验是对化学物质进行毒理学评价的一个重要方面，因为不同化学物质及剂量大小，在毒物动力学或代谢方面的物种差别往往对毒性作用影响很大。在毒性试验中，原则上应尽量使用与人具有相同毒物动力学或代谢模式的动物品系来进行试验。研究受试物在实验动物和人体内吸收、分布、排泄和生物转化方面的差别，对于将动物试验结果外推到人和降低不确定性具有重要意义。10 保健食品安全性的重新评价 安全性评价的依据不仅仅是安全性毒理学试验的结果，而且与当时的科学水平、技术条件以及社会经济、文化因素有关。因此，随着时间的推移，社会经济的发展、科学技术的进步，当对原料或产品的安全性研究有新的科学认识时，应结合产品上市后人群食用过程中发现的安全问题以及管理机构采取的与安全有关的管理措施，对产品的安全性进行重新评价。保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）1 范围本指导原则规定了保健食品原料用细菌、丝状真菌（子实体除外）和酵母的安全性评价中的致病性（毒力）检验与评价程序和方法。本指导原则适用于保健食品原料用菌种（包括保健食品配方用及原料生产用菌种）的致病性检验与评价。本指导原则不适用于基因改造微生物菌种和在我国无使用习惯的菌种致病性检验与评价。2 术语和定义2.1 致病性，Pathogenicity微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力。2.2 产毒能力，Toxigenicity微生物产生对人和动物有毒作用的活性代谢产物的能力。2.3 毒性，Toxicity微生物及其代谢产物对机体可能造成的潜在伤害（不良反应）。3 对拟评价微生物菌种需提交的基本资料要求在进行致病性评价试验前，菌种送检单位需提供以下资料供评价单位审核。3.1 基本信息拟评价菌种名称（包括学名、俗名、曾用名、拉丁名等）、来源及用途。3.2 菌种分类学资料提供由有菌种鉴定资质的机构出具的对拟评价菌种的规范、科学的分类学（属、种名称及株）资料。细菌的分类和命名应遵循原核生物分类学国际委员会（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的规定，并符合原核生物国际命名法规（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）要求。真菌的分类和命名应按国际藻类、真菌和植物命名法规（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）进行。3.3 菌种鉴定资料根据目前已有的知识，提供基于表型及基因测序技术鉴定到种水平的资料。作为保健食品的功效成分（活菌），还应提供鉴定到株水平的资料。3.4 菌种生长环境条件资料提供拟评价菌种生长最适培养基及培养条件（培养时间、培养温度和湿度、光照等），以及菌种保藏及复壮方法等相关资料。3.5 诱变菌种经过诱变的菌种还需提供详细的菌种诱变方法（包括使用的诱变剂、诱变条件及诱变试验流程等）和不少于100代（传代间隔不少于7天）的遗传稳定性研究报告。3.6 生产相关信息包括但不限于拟评价菌种安全用于保健食品的生产记录、工艺流程、企业标准等资料。3.7 国内外安全性评价资料综述基于国内外文献数据，提供拟评价菌种的国内外使用历史和安全性评价资料，包括其致病性和产毒能力的报告、研究文献或综述等；若无拟评价菌种的上述资料，应提供在亲缘关系上与其相近种属的安全性评价资料。3.8 其他国家批准资料 提供其他国家已批准拟评价菌种作为膳食补充剂、功能食品或普通食品生产使用的相关证明资料。3.9 其他需要说明的信息。4 评价方法对已经提供以上资料的拟评价菌株，可以按照以下方法开展评价。4.1 全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）4.1.1 基因测序对拟评价菌株进行全基因组测序，分别获得其基因组完成图和框架图，测序报告应包括（但不限于）以下信息： -DNA提取方法-测序方案及仪器设备-序列组装方法-序列质量评价-FASTA文件-与预期基因组大小相关的重叠群（Contigs）总长度-基因注释流程-对真菌而言，还需提供从相关数据库中获得的全基因组注释质量信息。4.1.2 基因序列分析将拟评价菌株的全基因组序列与已有的数据库，包括但不限于毒力基因数据库（VFDB）、毒力/致病岛数据库（PAIDB）、生物防御数据库（MvirDB）等最新版本中存储的序列进行比对，并分析拟评价菌株遗传物质中与致病明确相关的已知毒力因子和毒素代谢相关基因的存在情况。应提供包括（但不限于）以下信息的分析报告：-毒力/致病性（或产毒）相关基因名称、所在位置、与最新数据库中已有毒力基因的匹配度等信息-编码的蛋白及序列号-毒力/致病因子（毒素产生、侵袭和粘附因子等）-序列长度覆盖度60%-输入序列与数据库中序列的匹配度（85%）和e值（10-5）-数据库中已有的菌株名称-基因组图谱-拟评价的真菌菌株还应根据文献报道能够产生的毒素类别，针对性检索是否存在毒素合成关键基因及其基因簇。4.2 动物致病性试验由具备菌种致病性检验和评价资质的机构，分别按照附录A、附录B和附录C规定的试验方案，对拟评价的保健食品用细菌、丝状真菌、酵母菌株开展致病性检验，对结果做出评价并出具报告。4.3 产毒试验对某些能够产生毒素的微生物，应在多种基质和条件下（单品种固体、多品种固体复合、不同成分的液体组合等）进行产毒试验，并按照国家标准检测方法或国际组织/相关国家规定的标准检测方法进行有毒活性代谢产物含量检测。5 结果判定5.1 满足以下所有条件者，可用于保健食品。5.1.1 动物试验显示无致病性。5.1.2 产毒试验结果显示，在受试的任何一种基质中均不产生有毒活性代谢产物。5.1.3 根据现有知识，全基因组序列分析未发现存在已知的毒力/致病基因（或毒素合成关键基因及其基因簇）。5.2 全基因组序列中发现含有已知毒力/致病基因（或毒素合成关键基因及其基因簇），但动物试验显示不具有致病性、或产毒试验检测到已知的有毒活性代谢产物但其水平较低，长期摄入对人体健康无影响，结合国内外使用历史，可用于保健食品。5.3 动物试验显示具有致病性，或产生高水平已知有毒代谢产物，长期摄入可能影响人体健康，不能用于保健食品。附录A (规范性附录) 保健食品原料用细菌致病性检验方法1 范围 本方法规定了保健食品原料用细菌的致病性检验方法。 本方法适用于保健食品原料用细菌的致病性检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌和培养设备外，其他设备与材料如下：2.1 恒温培养箱：361。2.2 离心机：离心力3000 g。2.3 电子天平：感量0.1 g 和0.001 g。2.4 比浊仪。2.5 温湿度计。2.6 显微镜：10100。2.7 厌氧培养装置：厌氧罐、厌氧箱。2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。2.9 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。2.10 无菌试管：16 mm160 mm。2.11 无菌培养皿：直径90 mm。2.12 无菌量筒：容量100 mL。2.13 微量移液器及配套枪头：量程为100 L1000 L。2.14 注射器：量程为100 L1000 L。2.15 小鼠灌胃针头。3 培养基和试剂3.1 无菌生理盐水：商品化的生理盐水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸馏水中，分装后121高压灭菌15 min，备用。3.2 LB肉汤培养基：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，备用。3.3 LB琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，制备LB琼脂平板，备用。3.4 半胱氨酸盐酸盐储备液：称取500 mg半胱氨酸盐酸盐于50 mL无菌离心管中，加入10 mL蒸馏水，充分溶解后用0.22 m微孔滤膜过滤除菌后备用。3.5 含有半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤培养基：商品化MRS肉汤培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，待培养基冷却至50左右时，加入按3.4制备的半胱氨酸盐酸盐储备液，使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500 g/mL，备用。3.6 含有半胱氨酸盐酸盐MRS琼脂平板：商品化MRS琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，待培养基冷却至50左右时，加入按3.4制备的半胱氨酸盐酸盐储备液，使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500 g/mL，用于制备含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板。3.7 含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板：商品化双歧杆菌琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，待培养基冷却至50左右时，加入3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储备液，使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500 g/mL，用于制备含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板。4 实验动物选用SPF级昆明或ICR健康成年小鼠，雌雄各半，体重范围为18.0 g22.0 g。5 操作步骤 所有拟评价的菌株必须使用腹腔注射和经口灌胃两种途径给予动物受试物，以评价不同受试物暴露途径对动物的致病性。5.1 腹腔注射5.1.1 菌株活化目前我国已批准的可用于保健食品的细菌主要是双歧杆菌属和乳杆菌属，除这两个属以外的其他新申报菌种在以下描述中均使用“其他细菌”。根据送检菌株的保存状态，将双歧杆菌和乳杆菌首先接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤、其他细菌接种LB肉汤或适于该菌生长的最适液体培养基中，并置适宜的培养条件下（包括培养温度、湿度，厌氧、需氧、微需氧等）培养一定时间（培养时间长短视不同菌种而异）。5.1.2 菌悬液制备将5.1.1中活化的双歧杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板或含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板（乳杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板，其他细菌接种LB琼脂平板或适应于该菌生长的最适培养基琼脂平板），在规定的适宜培养条件下（包括培养温度、湿度，厌氧、需氧、微需氧等）培养一定时间（培养时间长短视不同菌种而异）后，刮取平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度并比浊，使最终菌悬液中的菌浓度达到5.0107 CFU/mL，用于小鼠腹腔注射。5.1.3 注射小鼠不少于40只，雌雄各半，随机分成4组（每组不少于10只），包括雄性小鼠无菌生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组。每只小鼠注射0.2 mL，即受试物组每只小鼠注射菌量不少于1.0107 CFU。5.1.4 观察动物腹腔注射后每天观察1次，至少连续观察21 d。观察并记录小鼠皮肤和毛、眼睛和粘膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。特别注意观察是否出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏迷等现象。试验前称量并记录所有小鼠的体重，试验结束后称量并记录所有存活小鼠的体重。对于试验期间死亡的小鼠，尽可能精确记录小鼠的死亡时间，同时称重并记录。5.2 经口灌胃5.2.1 菌数预估无菌吸取上述5.1.1的培养液，分别加至两个无菌离心管中，每管1 mL，3000 g 离心10 min，弃去上清液后，用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度并比浊，使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5108 CFU/mL和1.25109 CFU/mL，并分别记录每mL培养液离心后所得沉淀物中细菌数调整至2.5108 CFU/mL和1.25109 CFU/mL时需加入的无菌生理盐水的体积（mL）。5.2.2 菌悬液制备5.2.2.1 培养上清液的制备根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌株培养液用量。吸取5.1.1培养液，将培养液一分为二，3000 g 各离心10 min后，将上清液分别转至100 mL无菌量筒中，一份上清液用于菌悬液原液的制备，另一份上清液冷冻浓缩至原体积的五分之一，作为5倍浓缩上清液，备用。5.2.2.2 菌悬液原液的制备按照5.2.1中获得的细菌终浓度达到2.5108 CFU/mL所需要的生理盐水体积，根据离心的培养物体积，按相同比例加入5.2.2.1获得的上清液，调整离心后的沉淀物使其细菌数达到2.5108 CFU/mL（上清液量不够时可用空白培养基补齐）。5.2.2.3浓缩菌悬液的制备按照5.2.1中获得的细菌终浓度达到1.25109 CFU/mL所需要的生理盐水体积，根据离心的培养物体积，按相同比例加入5.2.2.1获得的5倍浓缩上清液，调整离心后的沉淀物使其细菌数达到1.25109 CFU/mL。5.2.3 灌胃 小鼠不少于80只，雌雄各半，分别随机分成8组（每组不少于10只），包括雄性小鼠培养基对照组、雄性小鼠菌悬液组、雄性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠5倍浓缩菌悬液组；雌性小鼠培养基对照组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雌性小鼠5倍浓缩菌悬液组。各组均以20 mL/kgBW的体积给小鼠灌胃，连续灌胃3 d，首次灌胃前小鼠应禁食过夜（16 h），灌胃后3 h4 h喂食。5.2.4 观察 动物经口灌胃后每天观察1次，至少连续观察21 d，观察指标同5.1.4。6 结果与报告对5.1和5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价，包括：（1）受试物对动物一般健康情况有无不良影响。（2）受试物对动物体重等指标的影响。（3）受试物组动物死亡情况。（4）若受试物组动物在试验期间未出现中毒症状或死亡，且体重等指标与对照组相比差异无统计学意义，即可判定该菌株无致病性；若受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡，或试验期间体重等指标与对照组相比有显著性差异，即可判定该菌株具有致病性。附录B(规范性附录) 保健食品原料用丝状真菌的致病性检验方法1 范围 本方法规定了保健食品原料用丝状真菌的致病性检验方法。 本方法适用于保健食品原料用丝状真菌的致病性检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：281。2.2 电子天平：感量为0.1 g。2.3 锥形瓶：容量为500 mL。2.4 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。2.5 显微镜：10100。2.6 微量移液器及配套枪头：量程为100 L1000 L。2.7 血球计数板。2.8 注射器：量程为100 L1000 L。2.9 小鼠灌胃针头。2.10 温湿度计。2.11 接种钩。2.12 球磨仪或功能相当的仪器。2.13 无菌培养皿：直径90 mm。3 培养基和试剂3.1 麦芽汁琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，制备麦芽汁琼脂平板，备用。3.2 马铃薯葡萄糖琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，制备马铃薯葡萄糖琼脂平板，备用。3.3 无菌生理盐水：商品化的生理盐水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸馏水中，分装后121高压灭菌15 min，备用。如拟评价菌株在上述两种培养基上的生长状态和产孢子量均不理想，可选用适于该菌株生长和产孢的其他培养基。4 实验动物选用SPF级昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，体重范围为18.0 g22.0 g。5 操作步骤 所有拟评价菌株必须使用腹腔注射和经口灌胃两种途径给予动物受试物，以评价不同受试物暴露途径对动物的致病性。5.1 腹腔注射5.1.1 菌悬液制备5.1.1.1 产孢子量大的菌株：将拟评价菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板（红曲霉属菌株接种麦芽汁琼脂平板）或适于拟评价菌株生长的培养基平板，281培养7 d14 d后，挑取平板上的孢子，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用血球计数板计数孢子浓度，并用适量无菌生理盐水调整，使其最终浓度不低于5.0107 CFU/mL。5.1.1.2 产孢子量少或不产孢子的菌株：将拟评价菌株接种于适宜的培养基上， 281下培养7 d14 d或在适宜的诱导产孢条件下培养一定时间后，挑取平板的菌丝体及孢子，用球磨仪（或其他功能相当的仪器）将菌丝体磨碎，经生理盐水重悬后，用血球计数板计数，并用适量无菌生理盐水调整，使菌悬液中菌丝体片段数/孢子的最终浓度不低于5.0107 CFU/mL。5.1.2 注射小鼠不少于40只，雌雄各半，分别随机分成4组（每组不少于10只），包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组，每只小鼠注射0.2 mL，即受试物组每只小鼠注射的菌量不少于1.0107 CFU。5.1.3 观察动物腹腔注射后每天观察1次，至少连续观察21 d，观察指标同附录A中的5.1.4。5.2 经口灌胃5.2.1 菌悬液制备除制备的菌悬液中真菌孢子/菌丝体片段的浓度不低于2.5108 CFU/mL外，其他操作步骤同5.1.1。5.2.2 灌胃 小鼠不少于40只，雌雄各半，分别随机分成4组（每组不少于10只），包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组，各组均以20 mL/kgBW的体积给小鼠灌胃1次，灌胃前禁食过夜（16 h），灌胃后3 h4 h喂食。5.2.3 观察 动物经口灌胃后每天观察1次，至少连续观察21 d，观察指标同附录A中的5.1.4。6 结果与报告对5.1和5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价，内容同附录A中的条款6。附录C(规范性附录) 保健食品原料用酵母的致病性检验方法1 范围 本方法规定了保健食品原料用酵母的致病性检验方法。 本方法适用于保健食品原料用酵母的致病性检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：281。2.2 电子天平：感量为0.1 g。2.3 锥形瓶：容量为500 mL。2.4 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。2.5 显微镜：10100。2.6 微量移液器及配套枪头：量程为100 L1000 L。2.7 血球计数板。2.8 注射器：量程为100 L1000 L。2.9 小鼠灌胃针头。2.10 温湿度计。2.11 接种环。2.12 离心机：离心力3000 g。2.13 无菌培养皿：直径90 mm。2.14 无菌量筒：容量100 mL。3 培养基和试剂3.1 麦芽汁琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，制备麦芽汁琼脂平板，备用。3.2 麦芽汁培养基：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制，充分加热溶解后分装，121高压灭菌15 min，制备麦芽汁培养基，备用。3.3 无菌生理盐水：商品化的生理盐水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸馏水中，分装后121高压灭菌15 min，备用。如拟评价菌株在麦芽汁培养基上的生长状态不理想，可选用适于该菌株生长的其他培养基。4 实验动物选用SPF级昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，体重范围为18.0 g22.0 g。5 操作步骤 所有拟评价菌株必须使用腹腔注射和经口灌胃两种途径给予动物受试物，以评价不同受试物暴露途径对动物的致病性。5.1 腹腔注射5.1.1 菌悬液制备将拟评价菌株接种麦芽汁琼脂平板，281培养一定时间（培养时间长短视不同菌种而异）后，刮取平板上的菌落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后用血球计数板计数，并用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度，使菌悬液中菌的最终浓度不低于5.0107 CFU/mL。5.1.2 注射小鼠不少于40只，雌雄各半，分别随机分成4组（每组不少于10只），包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组及雌性小鼠菌悬液组，每只小鼠注射0.2 mL，即受试物组每只小鼠注射的菌量不少于1.0107 CFU。5.1.3 观察动物腹腔注射后每天观察1次，至少连续观察21 d，观察指标同附录A中的5.1.4。5.2 经口灌胃5.