豆粕中三聚氰胺显微近红外成像检测的扫描条件优化.pdf
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1、第 29 卷 第 13 期 农 业 工 程 学 报 Vol.29 No.13 244 2013 年 7 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jul.2013 豆粕中三聚氰胺显微近红外成像检测的扫描条件优化 黎 静1,2,韩鲁佳1,杨增玲1(1.中国农业大学工学院,北京 100083;2.江西农业大学工学院,江西 南昌 330045)摘 要:为了确定豆粕中三聚氰胺显微近红外成像检测的最佳扫描条件,该文研究了扫描条件对显微近红外光谱图像质量、采集效率和豆粕中三聚氰胺检测效果的影响。针对不同光谱分辨率和扫
2、描次数对光谱图像均方根噪声(RMS)的影响进行了单因素方差分析试验,对干涉仪动镜移动速度(1、2.2 cm/s)、空间分辨率(25、50 m)、光谱分辨率(8、16、32 cm-1)和扫描次数(4、8、16 次)进行了多因素正交试验方差分析,结果得出光谱分辨率对 RMS 有显著性影响,而且采用不同扫描条件时显微近红外图像采集时间相差很大。根据图像质量、采集效率和豆粕中三聚氰胺检测效果分别得出优选扫描条件,综合考虑上述 3 个方面,最终推荐采用的扫描条件为空间分辨率为 25 m,干涉仪动镜移动速度为 1 cm/s,光谱分辨率为 32 cm-1,扫描次数为 4 次。该研究同时表明显微近红外成像技术
3、可应用于豆粕中三聚氰胺的检测。关键词:扫描,优化,成像技术,显微近红外成像,三聚氰胺,豆粕 doi:10.3969/j.issn.1002-6819.2013.13.031 中图分类号:O657.33;TP391.4;S816.46 文献标志码:A 文章编号:1002-6819(2013)-13-0244-11 黎 静,韩鲁佳,杨增玲.豆粕中三聚氰胺显微近红外成像检测的扫描条件优化J.农业工程学报,2013,29(13):244254.Li Jing,Han Lujia,Yang Zengling.Optimization of scanning conditions on near-infr
4、ared microscopic imaging for melamine detection in soybean mealJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(13):244254.(in Chinese with English abstract)0 引 言 显微近红外光谱成像(Near-infrared microscopic imaging,NIRM imaging)是利用光谱扫描手段获取样品中每一个空间点在一定波长范围内的
5、光谱信息,获 得 的 原 始 数 据 是 一 种 叫 做 超 立 方 阵(hypercube)的三维数据结构(xy)1,其中 x、y 为图像空间坐标信息,为波长信息。显微近红外光谱成像技术将近红外光谱技术、成像技术和显微技术相结合,光谱成像不仅可以获取样本的光谱信息,同时还可以获取样本的空间分布信息2,而显微可以满足微区或微区痕量检测的需求。该技术通过光谱数据中每个像素点的近红外光谱可反映出样本中各微区的内部信息,并据此进行样品的定性、定量或定位分析。显微近红外光谱成像技术对样本不需要进行常规化学方法中复杂的前处理,而且具有对环境无污染、操作要求低等优点,目前已 收稿日期:2013-02-25
6、 修订日期:2013-05-27 基金项目:Quality and safety of feeds and foods for Europe(QSAFFE)(KBBE-2010-2-4-03),欧盟第七框架项目(265702)作者简介:黎 静(1978),女,江西宜春人,博士生,主要从事农产品品质光学无损检测等方面的研究。北京 中国农业大学 工学院,100083。Email: 通信作者:韩鲁佳(1964),女,北京市人,教授,博导,主要从事生物质资源与利用的研究。北京 中国农业大学 工学院,100083。Email: 被广泛应用于农学3-7、医药学8-11、物证学12、生物学13、材料学14-
7、15等领域。三聚氰胺是一种低毒的化工原料,动物长期或反复大量摄入三聚氰胺会产生结石、肾衰竭甚至导致死亡16,因其含氮量(66%)比蛋白质(平均含氮量 16%)含有更高比例的氮原子,所以造假者常将三聚氰胺添加到蛋白饲料原料中以造成蛋白质含量较高的假象,对饲料安全构成威胁17。利用显微近红外光谱成像技术检测豆粕中的三聚氰胺,可建立化学计量学检测模型并将三聚氰胺的空间位置用图像反映出来,对三聚氰胺无损检测技术的发展具有重要意义。采集显微近红外光谱图像时包括光谱分辨率(resolution)、扫描次数(scans per pixel)、空间分辨率(pixel size)、干涉仪动镜移动速度(inter
8、ferometer speed)等几个扫描参数。光谱分辨率指的是光谱仪能分辨的光的最小波长间隔;扫描次数是指光谱图像多次扫描的次数,采集的光谱图像数据中的光谱是多次扫描的平均光谱;空间分辨率指的是检测器检测的像素点大小,即所能分辨的最小目标大小,反映的是成像系统空间分辨能力的大小;干涉仪动镜移动速度反映的是扫描速度的快慢。选择不同的扫描条件对光谱图像质量会有一定的影响,继而影响后续的分析和检测结果。关于扫农产品加工工程 第 13 期 黎 静等:豆粕中三聚氰胺显微近红外成像检测的扫描条件优化 245 描条件对近红外光谱分析的影响,之前已有一些研究人员分别针对不同的研究对象进行过相关研究,主要是从
9、光谱分辨率18-24、扫描次数24、样品粒度23等方面进行分析,研究表明不同因素对光谱质量和检测结果会产生不同程度的影响。鉴于此,本文以豆粕和三聚氰胺为研究对象,分别从光谱图像质量、采集效率、三聚氰胺检测效果等方面分别优选出扫描条件,再综合考虑确定最终的扫描条件,为后续豆粕中三聚氰胺检测的研究规范试验条件,也为其他研究人员进行相关研究提供参考。1 材料与方法 1.1 样本制备 试验所用三聚氰胺为三聚氰胺分析纯(99.5%,购自国药集团化学试剂有限公司),无味,白色粉末状固体。豆粕由中国农业科学院提供,豆粕样本经 ZM200 型超离心研磨仪(Retsch GmbH,德国)粉碎粒度至 1.0 mm
10、 以下。对于不同扫描条件对图像质量的影响试验,考虑到当豆粕中掺有三聚氰胺时,它们之间的位置关系通常会出现三聚氰胺位于豆粕上方、三聚氰胺位于豆粕下方、三聚氰胺位于豆粕旁边这 3 种极端情况,制备样本时在光学显微镜下将不同三聚氰胺和豆粕颗粒按照上述 3 种位置关系分别摆放在标准白板(材料为聚四氟乙烯)上。由于三聚氰胺和豆粕颗粒本身性质不同,比如样本的表面粗糙度、厚度、颗粒度大小等,为避免其对优化扫描参数的影响,试验时共制备 10 个样本做重复,豆粕和三聚氰胺粒度均 1.0 mm 以下。对于不同扫描条件对显微近红外图像采集效率和豆粕中三聚氰胺检测效果的影响试验,共制备了 3 个不同的试验样本。一个样
11、本制备时是将粒度均大于 250 m 的 4 个三聚氰胺颗粒分别放置于厚度为 30、50、100、110 m 的豆粕颗粒下面摆放到标准白板上。另 2 个样本根据实际生产掺假经济性,往粒度1.0 mm以下的豆粕中掺入1%的三聚氰胺配制混合样本,其中一个样本是将筛分后粒度大于50 m 的三聚氰胺与豆粕混合,另一个样本是将筛分后粒度小于 50 m 的三聚氰胺与豆粕混合,将混合样本分别平铺到标准白板上完成制备。1.2 试验仪器 显微近红外光谱成像所用的试验仪器为Spotlight 400 型傅里叶显微红外成像系统(英国,PerkinElmer Ltd.公司),该系统主要由红外和可见光源、干涉仪、可移动载
12、物台、显微光学成像系统、分光系统、检测器、CCD 照相机、图像采集和控制系统、计算机等部分组成,示意图如图 1。该系统将16个MCT红外检测器元件合并成为线阵列检测器,与干涉仪相连的载物台顺次沿着纵横 2 个方向移动逐点同步扫描出样本的光谱图像。图 1 Spotlight 400 显微红外成像系统示意图 Fig.1 Schematic diagram of Spotlight 400 NIRM imaging system 1.3 显微近红外光谱图像的采集 将制备样本的标准白板固定到垫片上,装入载物台中。采集显微近红外光谱图像时先对样本进行可见光显微成像,图 2a)是其中一个样本在光谱成像系统
13、中得到的可见光图像,然后从可见光图像中选择要进行分析的区域,采集其显微近红外光谱图像,如图 2b)所示。光谱图像用系统配套的SpectrumIMAGE 软件进行采集。a.样本的可见光图像 Visible image b.样本的显微近红外光谱图像 NIRM image 注:s1.三聚氰胺位于豆粕上方,s2.三聚氰胺位于豆粕下方,s3.三聚氰胺位于豆粕旁边 Note:s1.melamine on soybean,s2.melamine under soybean,s3.melamine near soybean 图 2 样本图像 Fig.2 Image of sample 农业工程学报 2013
14、年 246 1.4 试验方法 1.4.1 不同扫描条件对图像质量的影响试验 1)光谱分辨率单因素方差分析试验 光谱噪声是衡量光谱图像质量的一个重要指标,而均方根噪声(root mean square noise,RMS noise)是光谱噪声中常用的一种表达方式。本试验将光谱分辨率分别设置为 2、4、8、16、32、64 cm-1,其他扫描参数取固定值,扫描次数取 8 次,干涉仪动镜移动速度取 1 cm/s,空间分辨率取 50 m 50 m,光谱扫描波长范围取 7 8004 000 cm-1,采集不同光谱分辨率下 10 个样本的光谱图像,每个样本取其光谱图像的平均光谱,通过单因素方差分析研究光
15、谱分辨率对 RMS 的影响。2)扫描次数单因素方差分析试验 本试验将扫描次数分别取 2、4、8、16、32、64次,其他扫描参数取固定值,光谱分辨率取32 cm-1,干涉仪动镜移动速度取 1 cm/s,空间分辨率取50 m50 m,扫描光谱范围 7 8004 000 cm-1,采集不同扫描次数时 10 个样本的光谱图像,每个样本取其光谱图像的平均光谱,通过单因素方差分析研究扫描次数对 RMS 的影响。3)多因素正交试验 以 Spotlight400 显微近红外成像系统中的空间分辨率、干涉仪动镜移动速度、光谱分辨率、扫描次数 4 个扫描参数为试验因素进行正交试验设计。对于空间分辨率因素,该系统可
16、选 6.25 m 6.25 m、25 m25 m、50 m50 m 3 种,但当空间分辨率选 6.25 m6.25 m 时,采集到的光谱能量低(约为 2525、5050 m 时的 1/3),并且采集一个 12 mm12 mm 大小的光谱图像至少需要耗时 20 h,同时数据文件非常大,这将不利于快速检测的实现,因此正交试验中空间分辨率因素选择25 m25 m、50 m50 m 2 个不同水平。对于干涉仪动镜移动速度因素,该系统只有 1 和 2.2 cm/s 2 个水平。此外,光谱分辨率、扫描次数两个因素的不同水平由其单因素方差分析试验的结果确定。正交试验各因素及其水平如表 1 所示,采用 SPS
17、S Statistics R17.0(美国,SPSS Inc.公司)软件设计的正交试验方案进行多因素方差分析试 表 1 正交试验因素水平表 Table 1 Factors and levels of orthogonal test 因素 水平 空间 分辨率 A Pixel size/m 干涉仪动镜 移动速度 B Interferometer speed/(cms-1)光谱 分辨率 C Resolution/cm-1 扫描次数 DScans per pixel/times 1 2525 1 8 4 2 5050 2.2 16 8 3 32 16 验。对每种试验方案扫描样本的光谱图像,每个样本取其
18、光谱图像的平均光谱,研究各因素对 RMS的影响,并根据试验结果方差分析优选扫描条件。1.4.2 不同扫描条件对采集效率和三聚氰胺检测效果的影响试验 本试验分别采集制备的不同豆粕厚度下放置三聚氰胺颗粒的样本、含有 1%质量分数且粒度大于 50 m 三聚氰胺以及含有 1%质量分数且粒度小于 50 m三聚氰胺的掺假豆粕样本的显微近红外光谱图像,研究不同扫描条件对显微近红外光谱图像采集时间、不同厚度豆粕下三聚氰胺颗粒的检测效果、豆粕中含有 1%质量分数不同粒度三聚氰胺颗粒的检测效果的影响,并分别得出优选扫描条件。1.5 数据分析与处理 均方根噪声RMS指的是一条光谱在某波数(横坐标)区间内 n 个数据
19、点纵坐标值(吸光度值)的均方根偏差,用软件 Matlab 2010b(美国,MathWorks Inc.公司)按公式(1)进行计算,其值越小,反映光谱质量越好。首先计算出显微近红外光谱图像中每一个像素点对应光谱的 RMS 值,然后计算整个图像所有像素点光谱的 RMS 值的平均值,该平均值即为该图像的 RMS 值。单因素方差分析以每个样本图像的 RMS 值进行方差分析,多因素正交试验时取每种试验方案下所有样本的光谱图像的 RMS 的平均值作为每种试验方案的试验结果进行方差分析。单因素和多因素方差分析用SPSS Statistics R17.0 软件完成。21()niiyyRMSn=(1)式中,y
20、i为第i个光谱数据点的吸光度值;y为n个光谱数据点吸光度的均值;n为光谱数据点个数。验证试验中用PerkinElmer公司的图像处理软件HyperView V2.0对光谱图像进行主成分分析25(principal component analysis,PCA)处理,对比各扫描条件对不同豆粕厚度下三聚氰胺和豆粕中含有不同粒度三聚氰胺的检测效果。2 结果与分析 2.1 不同扫描条件对光谱图像质量的影响 2.1.1 光谱分辨率对光谱图像质量的影响 对不同分辨率下10个样本图像RMS值进行单因素方差分析,当光谱分辨率分别取2、4、8、16、32、64 cm-1时,对RMS进行单因素方差分析的结果表明这
21、些光谱分辨率得出的光谱RMS值有显著性差异(p=00.05)。图3为一个样本在不同光谱分辨率下三聚氰胺颗粒上一个像素点的光谱图,从第 13 期 黎 静等:豆粕中三聚氰胺显微近红外成像检测的扫描条件优化 247 图中可看出,三聚氰胺光谱在6 8506 500 cm-1范围内有3个吸收峰,这是由分子中的-NH2一倍频引起的。而5 1504 100 cm-1范围的多个吸收峰则是分子中含氮杂环和-NH2的合频吸收。光谱分辨率越高,其特征峰的分离效果越好,光谱图像区分三聚氰胺和豆粕的能力就越强;但当光谱分辨率提高到一定数值后,再提高光谱分辨率光谱的噪声将会增加。如图3 a所示,当光谱分辨率取2 cm-1
22、时,其光谱噪声非常大,图谱质量很差,并且光谱分辨率越高,采集图像文件所需时间越长,相应数据文件越大,于是将其剔除,光谱分辨率分别取4、8、16、32、64 cm-1,结果得出的图像RMS仍有显著性差异(p=0.0230.05)。采集光谱图像时应该选择大小合适的光谱分辨率,该光谱分辨率既要保证光谱的质量,同时又要保证检测对象特征峰的出现。如图3所示,当降低分辨率可提高光谱的信噪比,但光谱分辨率降到64 cm-1时,如图3f,与其他光谱分辨率下的三聚氰胺光谱图相比,在6 8106 550 cm-1范围内6 711、6 553 cm-1附近的2个吸收峰以及5 1504 100 cm-1范围内5 11
23、0、4 860、4 181 cm-1附近的三个吸收峰没有完全分离出来,这将对三聚氰胺的检测效果造成影响,因而将该光谱分辨率64 cm-1剔除。结合上述结果确定光谱分辨率取8、16、32 cm-1这3个水平用于多因素正交试验设计。注:扫描次数取 8 次,干涉仪动镜移动速度取 1 cm/s,空间分辨率取 50 m 50 m,光谱扫描波长范围取 7 8004 000 cm-1 Note:scans per pixel was 8,interferometer speed was 1 cm/s,pixel size was 50 m 50 m and the wavenumber range was
24、7 8004 000 cm-1 图 3 不同分辨率下三聚氰胺样本的光谱图 Fig.3 Spectra of melamine at different resolutions 农业工程学报 2013 年 248 2.1.2 扫描次数对光谱图像质量的影响 显微近红外图像采集时与近红外光谱类似,检测器的噪声占了总噪声的主要部分并且是随机的,若扫描次数过少,光谱质量较差,因而采集时需要采用通过多次扫描取平均值的方法。试验对不同扫描次数下10个样本图像RMS值进行单因素方差分析,当扫描次数分别取2、4、8、16、32、64次时,对光谱图像RMS进行单因素方差分析的结果表明这些扫描次数采集的图像RMS值
25、有显著性差异(p=00.05)。但次数过多,光谱图像采集时间会很长,因此结合图像光谱质量与采集效率本文选择4、8、16次作为多因素正交试验扫描次数的水平。注:光谱分辨率取 32 cm-1,干涉仪动镜移动速度取 1 cm/s,空间分辨率取 50 m50 m,扫描光谱范围 7 8004 000 cm-1 Note:resolution was 32 cm-1,interferometer speed was 1 cm/s,pixel size was 50 m50 m and the wavenumber range was 7 8004 000 cm-1 图 4 不同扫描次数下三聚氰胺样本的光谱
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