茶叶中色素的测试方法概述.pdf

第 3 5 卷第 2期 2 0 0 9年 3 月 中国测试 C HI NA ME AS URE ME NT&T ES r V0 l I 3 5 No 2 Ma r 2 0 o 9 茶叶中色素的测试方法概述 谭和平，叶善蓉，陈 丽，邹 燕(中国测试技术研究院，四川 成都 6 1 0 0 2 1)摘要：在参阅 1 9 0 7 年以 来国内外关于茶叶色素分析的 1 5 0 余篇文献的基础上，对茶叶中色素的分析方法做了较系 统的比较与研究，并针对茶叶色素的特点，就茶叶样品的前处理方法及 目 前常用的分析方法f 主要包括 R o b e r t s 法、柱 层析法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等)进行了评述，建议对茶叶色素测定的前处理，测定条件及最佳测试方法 实行标准化，以确保测试结果的可比性、可靠性。关键词：茶叶；色素；茶黄素；高效液相色谱法；毛细管电泳法 中图分类号：T S 2 7 2；T S 2 9 7 文献标识码：A 文章编号：1 6 7 4 5 1 2 4 2 0 0 9)0 2 0 0 7 8 0 5 Ov e r v i e w o f t e a p i g me n t d e t e r mi n a t i o n s T AN He-p i n g，YE S h a h-ran g，CHEN L i，Z OU Ya n (N a ti o n a l I n s t i t u t e o f Me a s u r e m e n t a n d T e s ti n g T e c h n o l o g y，C h e n g d u 6 1 0 0 2 1，C h i n a)Ab s t r a c t：MO re t h a n 1 5 0 l i t e rat u r e s a b o u t the d e t e r mi n a t i o n o f p i g me n t s i n t e a s i n c e 1 9 0 7 h a d b e e n c o n s u l t e d 1 1 1 e a n a l y s i s me tho d s o f p i g me n t s i n t e a we r e s y s t e ma ti c a l l y c o mp a r e d a n d s t u d i edAn d a c c o r d i n g t o the f e a t u r e s of p i gm e n t s i n tea，tho s e d e t e r mi n a ti o n me thod s an d the p r e t r e a t me n ts o f t e a w e re i n t r o d u c ed E s p e c i a l l y the p ri ma r y ana l y s i s me thods w e re e mp h asi z e d，s u c h as Ro ber t s me tho d，h i s h p e rf o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y，c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s an d S O o n As a res u l t，t h e a u tho r s s u g g e s t tha t the o p i mi z e d p i gm e n t d e t e r mi n a ti o n me thod a n d i ts c o n d i ti o n s an d the p ret r e a t me n t o f tea s h o uld b e s t a n d a r d i z ed t o ass u r e t h e c o mp a r a b i li t y and reli a b i l i t y o f d e t e rm i n a ti o n r e s ults Ke y wo r d s：T e a；P i g me n ts；Th e a fl a v i n；HP L C；CE 1 引 言 色素是一类存在于茶树鲜叶和成品茶中的有 色物质，是构成茶叶外形色泽、汤色及 叶底色泽的 成分，其含量和变化对茶叶品质起着至关重要的作 用【l】。在茶叶色素中，有的是鲜叶中已存在 的，称为 茶叶 中的天然色素；有 的则是在加工过程 中，一些 物质经氧化缩合而形成的。茶叶色素通常分为脂溶 性色素和水溶性色素两类，脂溶性色素主要对茶叶 干茶色泽及叶底色泽起作用，而水溶性色素主要对 茶汤有影响。本文就茶叶色素的性质及其分析方法 作一综述。2 茶 叶色素 的性质及分类 2 1 茶叶中的天然色素 茶叶中的天然色素分为脂溶性色素和水溶性 色素两类。收稿 日期：2 0 0 8 0 8 一 l 7：收到修改稿 日期：2 0 0 8 1 0 2 6 基金项目：国家科技条件平台(2 o o 4 D E A 7 1 1 8 0)作者简介：谭和平(1 9 5 7 一)，男，重庆市人，研究员，博士，主要 从事茶树生理生化研究。脂溶性色素是茶叶中可溶于脂肪溶剂的色素 物质的总称，主要包括叶绿素和类胡萝 卜 素。这 类色素不溶于水，易溶于非极性有机溶剂中。叶 绿素(C h l o r o p h y l 1)在鲜 叶 中与蛋 白质 类脂物质相 结合形成叶绿体，在制茶过程中叶绿素从蛋白体 中释放 出来。叶绿素 的组成及含量对茶叶品质有 一定的影响。类胡萝 卜 素(C a r o t e n o i d s)具有较强 的亲酯性，几乎不溶于水，且具有高度共轭双键 的发色 团和助色团，因而具有不 同颜色。类胡 萝 卜 素在茶叶制造过程中氧化降解，对茶叶香气具 有重要意义。水溶性色素是能溶解于水的呈色物质的总称。一般指花黄素类、花青素及儿茶素的氧化产物。花 黄素类(A n t h o x a n t h in)主要包括黄酮醇和黄酮两类 化合物，是茶叶水溶性黄色素的主体物质，是绿茶 汤色的重要组分。花青素类(A n t h o c y a n i d in)对茶叶 的叶底色泽、汤色及干茶色泽均有较大影响。2 2 茶叶加工过程中形成的色素 在茶叶加工过程中，会形成多种色素物质，其 第 3 5卷第 2期 谭和平等：茶叶中色素的测试方法概述 7 9 对构成茶叶品质特点及不同茶类的形成具有重要 作用。茶叶加工过程中形成的色素主要有茶黄素 类、茶红素类及茶褐素类。茶黄素(T h e a fl a v i n s，T F s)是红茶中的主要成 分，最早是由 R o b e r t s E A H(1 9 5 7)囱 发现的，是由 多酚类及其衍生物氧化缩合而来的能溶于乙酸乙 酯的、具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称。包括 茶黄素、茶黄素单没食子酸酯、茶黄素双没食子酸 酯等。由9种不同结构的化合物组成。B a i le y (1 9 9 0)等【3】利用高效液相色谱仪对红茶汤中的茶黄 素主要成分进行了测定，表明其主要为茶黄素、茶 黄素一 3 一 没食子酸酯、茶黄素一 3 一 没食子酸酯、茶黄 素一 3，3 一 双没食子酸酯。茶黄素色泽橙红，具有收敛性，对红茶 的色、香、味及品质起着重要的作用，是红茶汤色“亮”的主要 成分，是红茶滋味强度和鲜度的重要成分，同时也 是形成茶汤“金圈”的主要物质。茶黄素含量越高，则红茶汤色明亮度越好，呈金黄色；含量越低，则汤 色越深暗。茶黄素与咖啡碱、茶红素等形成络合物，温度较低时显出乳凝现象，是茶汤“冷后 浑”的重要 因素之一。茶黄素含量的高低直接决定红茶滋味的 鲜爽度，并且其含量的高低与叶底亮度也呈高度正 相关。茶黄素不仅是红茶 的重要品质成分之一，而 且具良 好的医药保健功能，早在 2 O 世纪 6 o 年代，我 国学者楼福庆等就发现茶 叶儿茶素的氧化产物 具有抗动脉粥样硬化与促纤溶作用【4 。近年来，大量 的研究表明，茶黄素不仅是一种有效的自由基清除 剂和抗氧化剂，而且具 有抗癌、抗突变、抑菌、抗病 毒、改善和治疗心脑血管疾病、治疗糖尿病等阁 多种 生理功能，在食品、医药保健等领域的作用也越来 越突出。茶红素(T h e a r u b i g i n s，T R s)是一类复杂的红褐 色的酚性化合物，是红茶氧化产物中最多的一类物 质，能溶于水，是构成红茶汤色的主体物质，对茶汤 滋味与汤色浓度起极重要的作用，并参与“冷后浑”的形成。此外，还能与碱性蛋白质结合生成沉淀物 存于叶底，从而影响红茶的叶底色泽。茶褐素(T h e a b r o w n i n e，rI B)为一类水溶性非透析 性高聚合的褐色物质，其主要组分是多糖、蛋白质、核酸和多酚类物质。呈深褐色，溶于水，是红茶茶汤 发暗、无收敛性的重要因素，其含量与红茶品质呈高 度负相关(-0 9 7 9)，含量增加时等级下降。3 茶色素的提取方法 茶色素在测定之前，需对其进行提取。茶黄素一 般采用热水提取，乙酸乙酯转溶，然后用 S e p h a d e x L H 一 2 0 柱层析分离，茶黄素异构体再辅以制备性纸 色谱分离，分离物可再利用 S e p h a d e x L H 一 2 0 柱层 析分离纯化，或者用高速逆流色谱法分离纯化。茶黄素粗提取物的制备，常用方法有 C o l l i e r 法 和U U a h 法。C o l l i e r 法具体操作为：红茶用热水浸提(8 O，5m i n)，浸提液过滤、浓缩、冷冻干燥，所得 的 红茶水可溶性物质用甲醇、水(体积比3：1)溶解，再 用三氯甲烷萃取，除去咖啡碱(C A F)等杂质。水相减 压浓缩，除去甲醇(C H，O H)和三氯甲烷(C H C 1 )，用 乙酸乙酯反复萃取 5次，萃取液用硫酸镁(M g S O )脱水，3 O 下蒸馏至干，得到茶黄素粗提物。该方法 工艺技术比较简单，但是有机溶剂用量多。U l l a h法具体操作为：用适量的磷 酸二氢钠与 乙酸乙酯混合萃取，茶红素能全部被固定在水相中，而茶黄素被 固定在有机相 中。碎红茶用沸水浸提 1 0 m i n(8 0 oC)，过滤，滤液减压浓缩，三氯甲烷萃取，除去咖啡碱等杂质，然后用磷酸二氢钠(N a H 2 P O )和乙酸乙酯混合萃取 3 次，乙酸乙酯层经减压浓缩 干燥，得茶黄素粗提物。该方法简单，只需 1 次萃 取，可较好地分离茶黄素。4 茶 叶色素 的分析方法 目前对茶叶色素的分析主要集中在对茶叶加 工过程中形成的色素，尤其是茶黄素的分析研究方 面，已有报道的文献有 9 0 余篇。茶红素次之，约 2 O 余篇。茶色素的分析测定方法有：R o b e rt s 法、仅 一 氨 基乙基二苯硼酸酯试剂(F l a v o g n o s t)分析法、A 1 C 1，比色法、S e p h a d e x L H 一 2 0 柱层析法(C C)、气相色谱 法(G C)、高效液相 色谱 法(H P L C)、毛细 管 电泳 法(C E)等。4 1 Ro b e rts法 根据茶黄素和一部分茶红素(s I 型游离态)溶 解于乙酸乙酯或 4 一 甲基一 戊酮(I B MK)，这部分可利 用其能溶于碳酸氢钠溶液而分离，s 型茶红素留 在水层。R o b e r t s 等(1 9 6 1)提出了茶黄素的分析方 法。其操作步骤如下：称取茶样 9 g，置于 5 0 0 m L 锥 形瓶 中，加沸水 3 7 5 m L，于沸水浴 中提取 1 0 m i n，用 脱脂棉过滤，冷却。吸取滤液 5 0 m L，注于分液漏斗 中，加入I B M K 5 0 m L，振摇(避免形成乳浊液)。吸取 I B M K层 2 5 m L，注于分液漏斗中，加 2 5 的碳酸氢 钠溶液 2 5 m L，强烈振荡 3 0 s，静置分层，弃取水层，立即吸取 I B M K层 4 m L，加甲醇定容至 2 5 m L(溶 液A)。在3 8 0 n m或 4 6 0 llm处测定吸光度。则：茶黄素()=E A 枷 6 6 9 或 E 瑚 2 2 5 中国测试 2 0 0 9 年 3 月 该法虽存在重复性差、测定含量值偏低的缺 点，但其方法简单、试剂价格便宜且可同时测定茶 红素的含量，故仍被包括我国在内的许多国家广为 采用。布库恰瓦(1 9 8 3)用乙醇代替了甲醇，对 R o b e r t s 法进行了修正。该法试剂用量少，操作简便，适用于大批量的分析。U l l a h M R Iq(1 9 8 6)对 R o b e r t s 法作 了进一步改进。用适量的磷酸二氢钠与乙酸乙 酯混合萃取，茶红素能全部被固定在水相中，而茶 黄素进入有机相。该法只需一次萃取，操作简化。C a s s o n(1 9 6 9)用 T r i s 一 盐酸缓冲剂代替碳酸氢钠对 R o b e r ts 法进行改进，该法可提高测定的可靠性。夏 涛、高丽萍即(1 9 9 9)借助 H P L C对 R o b e r t s 法进行了 分析，结果发现经碳酸氢钠萃取后 的乙酸 乙酯相在 3 8 0 n m和 4 6 0 n m图谱中只检出茶黄素类(T F s)，但 在碳酸氢钠相中，即R o b e r t s 认为的T R S I 部分中却 含有相当量的 T F s。因此，R o b e rt s 法 的 T F s 含量偏 低。要提高 R o b e rt s 法的精确度，就必需对 T R S I 的 组分分离方加以改进。此外，由于传统红茶 中茶黄 素 含单 没 食 子 酸酯 占 T F s总量 的 5 0 左 右，故 R o b e rt s 法是以该茶黄素组分为基准估计消光系数 的。事实上，传统功夫红茶、红碎茶和茶鲜叶匀浆悬 浮发酵红茶 中茶黄素含量不 同，后者中茶黄素(T F)组分含量高达 7 0 左右。同时，有的研究结果也表 明T F s 的各组分比例还受到地理分布、品种及发酵 条件的影响，因此，利用 R o b e rt s 法 比较不同类型的 茶黄素含量，或研究红茶发酵期 间茶黄素变化规 律，有可能影响其可比性。4 2 一 氨基乙基二苯硼酸酯试剂(F l a v o g n o s t)分析法 H it o n(1 9 7 3)提出的一种快速测定法。根据茶黄 素分子中的苯并卓酚酮核可以与 F l a v o g n o s t 试剂产 生特异性反应，产生绿色络合物，测定其吸光度换 算成茶黄素含量操作方法如下：称取红茶 9 g，置于 保温瓶中，加沸水 3 7 5 m L，振荡 1 0 m i n，用脱脂棉过 滤。吸取试液 1 0 m L注入试管中，加 I B MK I Om L，振 荡 1 5 mi n，静置分层。吸取上层液 2 m L注入另一试 管中，加乙醇 4 m L、F l a v o g n o s t 2 m L，振摇 2 m i n，静置 1 5 m i n，用 I B M K与乙醇(1：1)混合液作参 比，于波 长 6 2 5 n m处测吸光度(E)。则：茶黄素(I m o l g)=E x 4 7 9 0 m(m为试样干物 率()与 R o b e r t s 法相比，该方法具有更好的重现性，已被 E l li s(1 9 8 1)推荐为国际红茶最低质量标准的 检测方法。但是，再现性较差，该法受到提取液、提 取水温、水的p H值等因素影响，特别是 F l a v o g n o s t 仅与T F s 顺式上的两个羟基结合，故此茶浸提液中 只 8 5 的s 与 F la v o g n o s t 试剂结合生成绿色络合 物。此外，用 F l a v o g n o s t 测定具有不合理性。因为许 多产茶国很难买到 F l a v o g n o s t 试剂。4-3 氯化 铝(A 1 C 1 3)比色法 L i k o le c h e N k h o m a J W 等(1 9 8 8)用 A 1 C I 3 代替 了F l a v o g n o s t 试剂。因为铝盐与茶黄素复合产生红 色，于波长5 2 5 n m处具有最大吸收。其测定方法如 下：称取红茶 9 g，加沸水 3 7 5 m L，振荡 1 0 ra i n，用脱脂 棉过滤。吸取滤液 1 0 m L 注入试管中，加I B M K 1 0 m L，振荡后分层。吸取酮层 2 mL注入另一试管 中，加 0 0 5 MA 1 C 1 3：9 6 乙醇(1：2)混合液 6 m L，混匀后静置 1 5 mi n，于波长 5 2 0 n m或 5 2 5 n m处测吸光度(E)。则：茶黄素()=5 2 5 x 4 3 2 3 m或 5 2 0 x 4 7 8 0 m(m为 试样干物率()该方法 的测定值与 F l a v o g n o s t 方法没有显著差 异(测定值略高，但可以通过公式进行校正)。而 且，铝盐较为容易得到且价格不到 F l a v o g n o s t 试剂 的 1。但是，茶汤中加人过量的铝，会使茶汤变得 浑浊，再用 I B M K萃取，则形成乳浊液，即使离心分 离，仍有 2 0 的茶黄素留在水层中。4 4 S e p h a d e x L H 一 2 0柱层 析法(C C)此方法是竹尾忠一(1 9 7 3)提出的。其分析方法 如下：称取茶样 5 g置于 2 5 0m L锥型瓶 中，加沸水 2 0 0m L，在沸水浴中浸提 1 0 m i n，用滤纸过滤。吸取 滤液5 0 m L，加I B M K 5 0 m L，振荡 1 0 m i n。分层后，吸 取有机层 4 0 m L，于 4 7 下减压浓缩至干，加 4 0 丙 酮水溶液定容至2 5 m L。取 1 0 m L 加人柱(S e p h a d e x L H-2 0，用4 0 N酮水溶液浸泡过夜，装柱)上。洗脱 液体积分别为 3 6 0 mL、2 6 0 mL、1 2 0 mL 和 1 1 0 m L，流 速2 m IJ m i n，并得色谱峰图。用求积仪测峰面积，并得 相对含量。何文斌等(1 9 8 8)对茶黄素进行了S e p h a d e x L H 一 2 0 凝胶过滤的柱层析，结果发现，茶黄素一般 可分出三个部分，推测分别是茶黄素双没食子酸酯(T F G D)、茶黄素单没食子酸酯(T F M G)和茶黄素(T F)。该方法能有效地分离茶黄素，而且对茶黄素 的主要组分能定量，无疑提高了分析的精确度，但 操作复杂，S e p h a d e x L H 一 2 0 在市场上很难买到。4 5 Wh i t e h e a d法 Wh it e h e a d 等(1 9 9 2)利用色素极性大小差异，提 出了一种快速的茶黄素总量测定方法。其操作步骤如 下：1 g 红茶用 2 5 0 m L沸0 O 1 M(p H 5 0)的乙酸缓冲 液提 1 0 m i n。茶提取液用棉花过滤，然后用注射器取 第 3 5卷第 2期 谭和平等：茶叶中色素的测试方法概述 8 1 2 m L提取液注入 1 m L C 。吸附柱，用 2 0 mL酸化甲 醇(即2 5 甲醇醋酸溶液)，收集2 m L x l 0 m L 洗脱液(A)。在4 4 0 n m或 4 6 0 n m处测定 A的吸光度。则：茶黄素(m o l g)=O D 4 6 0 x 3 3 4 3 D M 或 O D 4 4o x 2 2 9 2 D M(D M 为在 1 0 3 下干燥 1 8 h的干物质 的量)该法更快捷，适于实验室和工厂化的常规检 测。但 B a i l e y(1 9 9 4)同样用 S e p P a r k C 。柱分离并 收集 3 5 和 8 0 甲醇溶液的洗脱液，H P L C分析表 明3 5 甲醇水溶液洗脱的极性部分在于 2 8 0 n m下 可见多酚类、咖啡碱和不溶性凸峰，4 6 0 n m下可见 类似于 T R I I 的物质；8 0 的甲醇水溶液洗脱 的非 极性部分于 2 8 0 n m下可见许多黄酮醇苷和 T F s，4 6 0 n m下可见类似于 T R S I的物质。由此认为 S e p P ark C 。柱并不能将 T R s、r F s 及黄酮醇苷有效 分离。O w 11 O g P。O。等(1 9 9 5)比较了几种测定方法，Wh i t e h e a d法偏高。4 6 高效液相色谱法(H P L C)B a i l e y R G 等(1 9 9 0)使用光 电二极管 阵列 检 测器 的反相 H P L C研究红茶浸出物的性质，四种茶 黄素能够得到分离纯化。由此提出了 H P L C法测定 茶黄素主要组分及其它物质的方法。红茶用沸蒸馏 水提取，在 8 O 水浴中提取 1 0 rai n，过滤得待测液。高效液相色谱仪用 5 Ix m(2 5 e m x 0 4 6 e m)柱，进样量 2 0I L(2 0 L样品环)。流动相为：溶剂 A为 2 含 水乙酸，溶剂 B为 乙腈。梯度洗脱：9 2 A+8 B到 6 9 A+3 1 B，梯度洗脱 5 0 rai n以上，流速 1,5 ml d mi n。Y o s h i n o 等(1 9 9 2)提出了一种 H P L C测定茶黄素等 物质的方法，能够测定范围在 0 1 p,g m L 一 1 0 g m L 的各种儿茶素和茶黄素单体，即四种茶黄素。梁月荣【8】(1 9 9 2)用高相液相色谱与光电二极管 阵列检测器耦联分析了红茶茶黄素类化合物。样 品前处理方法为：将鲜茶叶 1 k g 置于不锈钢盆在室 温下萎凋 1 4 h，用微型转子揉切机揉切，手工解块，并摊放在不锈钢盆内，厚约 2 c m，覆以两层湿纱布，置于发酵箱发酵 3 h。取发酵叶 2 0 g，置于5 0 0 m L 烧 杯，用微波炉在 9 0 加热 3 m i n，终止发酵。然后加 沸蒸馏水 1 5 0 m L冲泡 1 0 m i n，再用滤纸趁热过滤。吸取滤液 5 0 m L 于 1 5 0 m L 分液漏斗中，加 5 0 m L乙 酸乙酯，振摇 5 m i n，静置分层后，分离出水相并再 与5 0 m L乙酸乙酯振摇一次，分离后将两次乙酸乙 酯层合并，在 4 0。C 下减压浓缩至 1 0 m L。浓缩液作 纸层析分离，用 0 5 m L甲醇洗脱，待测。作者认为，如 需同时检测 I 与咖啡因和儿茶素类，用波长 2 8 0 砌效果较好；若同时测定 T F s 与黄酮醇及糖苷等成 分，在 3 8 0 n m扫描效果较理想。夏涛【9 1(1 9 9 9)使用岛津 L C 一 1 0 A型高效液相色 谱仪，对红茶中的茶黄素进行了分析。B e e l a n l e e 等(2 0 0 0)采用 P a r t S p h e r e C 1 8(4 6 mm x l 1 0m m，5 m)柱，柱温 3 2；流动相 A为 0 0 3 5 三氟乙酸，5 乙 腈；B为 0 0 2 5 三氟乙酸，5 0 乙腈；流速 1 O ra L ra i n。梯度程序为：0 rai n时，A B(9 0：1 0)；1 0 mi n 后 B提 高到 2 0，1 6 m i n 时提高到 4 0，2 0 ra i n 时提高到 5 0，在 2 5 rai n 2 7 ra i n时又 回到 4 0。用上述液相 色谱条件在 2 7 m i n内使四种茶黄素化合物和六种 儿茶素类化合物获得分离。H P L C法非常精确，并能使各茶黄素单体得到 较理想地分离，是目前测定茶黄素类化合物最常用 的方法。应用此种方法进行茶叶色素分析，需考虑 以下因素：(1)色谱柱的选择：茶黄素类物质是一类具有苯 并卓酚酮结构的多酚类物质，呈弱极性。B a i l e y 等四 的 研究表明，载体(硅胶)粒径范围较窄、高比表面积 的 H y p e s i l O D S柱可用 以分离 小分子质量 的多酚 类物质。根据茶黄素的分子结构特点、固定相 的选 择规律及对茶黄素类物质的分离经验，一般选择普 适性强、保留值大的分析柱。(2)流动相的优化：红茶中茶黄素的测定多采 用乙腈一 醋酸水溶液为流动相，但其色谱图峰形不 好、拖尾严重，且分离时间长。王坤波等t,o r fi-先采用 乙腈(A C N)一 2 醋酸水溶液(H A C)作 溶剂系统，4 种主要茶黄素物质只有 T F 一 3 一 G和 T F 一 3 一 G可分 离，而T F D G和 T F不能分离。虽然可以通过调整洗 脱梯度的程序使之分离，但分析时间长达 6 0 ra i n，不能满足快速分离的要求。实验发现，加入一定量 的乙酸乙酯(E t O A e)可使分离得到改善，且峰形尖 锐、不拖尾。当用 A C N E tO A e 一 2 H A C(体积比为 2 1：3：7 6)溶液作流动相进行等度洗脱时，4 种茶黄素 均可分离，但 T F D G、T F峰展宽较严重，使检测灵敏 度降低，且分析时间较长。另一方面，在测定茶黄素 提取物样品时，由于样品中杂质峰较多，茶黄素类 物质不能与杂质分离。为了使茶黄素组分得到较好 的分离，改用梯度洗脱。经多次优化洗脱程序，实验 发现 当 A C N E t O A e的体积分数在 3 0 m i n内 由 1 8 增加到 2 6 时，样品中4种茶黄素均能达到完 全分离，且分析时间缩短为 3 0 w i n。(3)检测波长的选择：据文献【lI】的报道，一般选 择检测波长均为 2 8 0 n l n。8 2 中国测试 2 0 0 9 年 3月 4 7 毛细管电泳法(C E)毛细管电泳(C E)又称高效毛细管电泳(H P C E)或毛细管电分离法(C E S M)，是一类以毛细管为分 离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离 技术，它于 8 O 年代中后期迅速发展。毛细管电泳实 际上包含电泳、色谱及其交叉内容，是分析科学中 继 H P L C之后的又一重大进展。C E有很多的优点，可概括为“三高两少”：高灵敏度，常用紫外检测 器的检测限可达 1 0 3 to o l 1 0 s to o l，激光诱导荧光 检测器则达 1 0-19 m o l 1 0 m o l；高分辨率，其每米 理论塔板数为几十万，高者可达兀 百万乃至千万；高 速度，最快可在 6 0 S 内完成，有 2 5 0 S 内分离 1 0 种 蛋白质、1 7 m i n 分离 1 9种阳离子及 3 ra i n内分离 3 O 种阴离子的报道；样品少，只需 n L 级的进样 量；成本低，只需少量流动相和价格低廉的毛细 管。以上优点使 C E成为近年来发展最迅速的分离 分析方法之一。近年来 C E在茶叶生化分析 中也有 所发展，使茶叶生化分析进入了一个新的领域。l e e 等n 采用 C Z E 测定 T F s 化合物。采用 4 0 c m x 5 0 m加长的光径毛细管柱，由 8 0 0 0 5 M硼酸(p H 7 2)、2 0 0 L 0 1 M磷酸二氢钾(p H 4 5)、4 5 0 L 0 1 2 M B 一 环糊精 和 5 5 0 I x L乙腈混 配成缓 冲液，2 5 k V、3 0 C 下电泳，2 0 5 n m波长下紫外检测。Wr i g h t 等【1 3 采用非水毛细管电泳(N A C E)法进 行了T F s 的测定，使用的毛细管有效长度为3 2 c m，用于分离的有机溶剂组成为乙腈：甲醇：醋酸=7 1：2 5：4(v v)和 0 0 9 M醋酸铵，电压 2 7 5 k V，柱温 1 8 5 c I：，在 3 8 0 n m波长下紫外检测，可在 1 0 m i n内达到T IP s 的基线分离，并且有效分离四种主要 T F s，标准曲线 成 良好的线性范围(1 0 0I x g m L 1 0 0 0 g m L)，四种，I F s(T F，T F 一 3 一 G，T F 一 3 一 G，T F D G)的相关系数分别 为 0 9 9 9 8,0 9 9 9 2、0 9 9 9 5和 O 9 9 8 7，在 3 8 0 n l n 的检测 限分别 为 2 4 g mL、2 5 I g m L、2 1 m L和 2 3 咖 L，相对标准偏差均小于 6，重复性 良好，更 适合于红茶中T F s 分析，红茶仅需一次沸水浸提和一 次I B M K萃取即可获得平稳的基线水平。同时他还使 用毛细管区带电泳(C a p i l l a r y Z o n e E l e c t r o p h o r e s i s，C Z E)对 T F s 进行了分析，缓冲液由0 0 5 M的硫酸 钾和 0 6 M的硼酸组成(p H 7 0)，电压 2 2 5 k V，柱 温 2 5，于 2 8 0 n m处紫外检测，发现 C Z E法使得区 带展宽，且存在样品预处理复杂、稳定性差和相对 标准偏差值较大的缺点。5 结束语 茶色素是茶叶品质成分的重要物质，但目前国 内外相关分析方法和标准的研究还不多。根据国内 外专家学者提出的关于茶叶中色素测定的方法，笔 者认为对这些方法的前处理、分析测定条件 以及茶 叶中各种色素的最佳测试方法等必须进行标准化 研究。只有经过标准化研究，才能使各实验室对茶 叶中色素的测试结果有可比性，测试结果的可靠性 才能得到保证。参考文献【1 1 宛晓春 茶叶生物化学 M】北京：中国农业出版社，2 0 0 3：2 1-3 4 【2 R o b e r t s E A H，C a r t w r i g h t R A，O l d s c h o o l M T h e p h e n o l i c s u b s t a n c e s o f ma n u f a c t u r c d t e a【J J S c i F o o d A s r i c ，1 9 5 7(8)：7 2 8 0 【3 B a i l e y R G，e t a 1 C o m p a r a t i v e s t u d y o f t h e r e v e r s Ie d p h a s e h i S h-p e rf o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y o f b hc k t e a l i q u o r s w i th s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h e t h e a r u b i g i n s J J o u rna l o f C h r o m a t o g r a p h y，1 9 9 1(5 4 2)：1 1 5 1 2 8 4 楼福庆，杨祖才，袁伟龙，等 茶色素对家兔实验性动脉 粥样硬化和人纤维蛋白原增多症的作用 J 中华医学 杂志，1 9 8 3，6 3(1 0)：6 3 2 【5】杜琪珍，江和源 茶色素的药理及其应用【J 中国茶叶，1 9 9 7，1 9(5)：3 6 3 7 【6 江和源，程启坤，杜琪珍，等 红茶中的茶黄素 J 中国 茶叶，1 9 9 8，2 0(3)：1 8 2 O 7 夏涛，高丽萍 红茶色素分离测定方法及其对品质影 响的研究概述叨 中国茶叶加工，1 9 9 9(2)：4 2-4 5 8 8 梁月荣 红茶茶黄素类化合物的高相液相色谱一 光电二 极管阵列检测 J】浙江农业大学学报，1 9 9 2(1 8)：7 O 7 4 9 9 夏涛 红茶色素形成机理的研究【J 茶叶科学，1 9 9 9，1 9(2)：1 3 9 1 4 J 4 1 o】王坤波，刘仲华，黄建安，等 高效液相色谱法测定红茶 中的茶黄素 J 色谱，2 0 0 4，2 2(2)：1 5 1 1 5 3 1 1 李大祥，宛晓春，刘莉华，等 茶色素中茶黄素类的H P L C 定量 M】茶叶科学，2 0 0 4，2 4(2)：1 2 4 1 2 8 1 2】L e e M J，P r a b h u S，Me n g X F，e t a 1 A n i mp r o v e d me tho d f o r t h e d e t e rm i n a ti o n of g r e e n a n d b l a c k t e a p o l y p h e n o h i n b i o ma t r i c e s b y h i g l l-perf o rma n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w i th c o u l o m e t r i e a r r a y d e t e c ti o n【J】A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y，2 0 0 0(2 7 9)：1 6 4-1 6 9 【1 3 Wri g h t L P，A u c a m p J P，A p o s t o li d e s Z A n a l y s i s o f b l a c k t e a t h e a t l a v i n s b y n o n-a q u e o u s c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s p 阴J o u r n a l o f C h r o ma t o g r a p h y A，2 0 0 1。9 1 9(1)：2 0 5 2 1 3