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《微生物检验基础知识》
（讲师手册）
主题
PPT页码
时间（h）
讲师活动
辅助讲授方式
（讨论、情景模拟、练习、其它）
相关活动
（运用案例、运用道具）
开场导入
1-4
3min
讲师进行自我介绍，并对本次课程实施的相关情况进行说明。
无
无
第一单元微生物学基知识

5-47
80min
核心概念 认识微生物，熟悉其特点
必讲内容：微生物定义、特点、地位、分类；细菌分类、形态、结构生长繁殖以及影响生长因素；霉菌，酵母菌形态及繁殖
一、微生物在生物界地位按幻灯片讲解
二、微生物定义、特点
1、定义：可以用三个字概括，即：小、简、低。
“小”指的是个体微小，肉眼看不到的，只能借助显微镜才能看到；
“简”指的是结构简单；
“低”是指在生物界中的进化地位最低。
2、特点：
a、分布广泛，种类多：到处都有，（空气中、土壤里、水中、空气
植物、人类、动物）随着环境的不同，菌的种类和数量也不同。

b、适应能力强，易变异：极其灵活适应性，对极端环境具有惊人的适应力。遗传物质易变异
c、体积小，面积大：细胞大小以微米和纳米计量，体积小，但比表面积较大。
d、代谢能力强，繁殖快： 1公斤的酵母菌在一天之内可使几吨糖全部转化为酒精和二氧化碳；乳酸杆菌20分钟繁殖一代,大肠杆菌12分钟繁殖一代。
可选内容：数量多 在局部环境中数量众多，（如肠道内微生物的总量可达到100万亿）。
三、微生物分类
1、微生物分类系统的通用单位依次为界、门、纲、目、科、属、种。最基本的是种。按照幻灯片讲解，简单介绍《伯杰氏细菌鉴定手册》，从1974年至1994年细菌增加了2500种。
2、微生物分类：主要是按细胞形态分：
（1）非细胞型（acellular microorganism）：病毒、亚病毒
（2）细胞型：
原核生物(prokaryotes)：细菌、放线菌等。特点是无明显核，也无核膜、核仁。
真核生物(eukaryotic microorganism)：酵母菌、霉菌。特点是有明显核，有核膜。、核仁。
幻灯片最后强调突出的细菌、霉菌和酵母菌，讲完微生物分类，自动承接一句我们目前能够开展检验的是细菌、霉菌与酵母菌，所以接下来首先介绍细菌
细菌共分10个方面进行介绍
1、细菌（简单概括细菌的特点）
是原核生物
1）呈单细胞
2）基因载体与细胞质之间无单位膜相隔（无核膜）
3)简单二分裂方式繁殖（在后面的有具体介绍）
2、细菌分类：一般按照四种方式进行分类
（1）按形态分
球状、杆状、螺旋状
（2）按细胞结构（染色）分（在后面介绍）
革兰氏阳性菌 (G+)
革兰氏阴性菌(G-)
强调革兰氏染色是鉴别细菌种类的重要方法
（3）按细菌呼吸类型分（对氧的需求在后面具体介绍）
需氧、厌氧（还有严格的）、兼性厌氧
（4）按代谢类型分：
①自养型：在生长时可以利用无机物作为唯一营养物质来源的微生物。
②异养型：生长时至少需要一种可被利用的有机物作为营养物质的微生物。
以下可选讲，根据微生物生长时的能量来源，可分为光能型和化能型，因此微生物的营养类型有光能自养型、化能自养型、光能异养型以及化能异养型四种类型。
a.光能自养型：能以CO2作为唯一或主要碳源，通过光合磷酸化将光能转变为化学能（ATP）供细胞利用，并以特定的无机化合物如H2O、H2S等作为供氢体还原CO2，合成细胞生长所需的各种复杂的有机物。这类微生物可以在完全无机的环境种生长，如蓝细菌、红硫细菌、绿硫细菌等少数微生物，这些细菌的细胞内都含有叶绿素或细菌叶绿素等光合色素，能够进行光合磷酸化。
b.光能异养型：光能异养微生物也可利用光能为能源，但需要以有机物为供氢体合成细胞物质。如红螺菌细菌菌属的一些细菌，能以异丙醇等有机物作供氢体，使CO2还原成细胞物质。
c、化能自养微生物：化能自养微生物可利用CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源，生长所需的能量来自于无机氧化所产生的化学能，利用某些特定的无机物如H2、H2S、NH3等供氢体还原CO2合成细胞物质。属于这类微生物的有硫化细菌、硝化细菌、铁细菌等。
d、化能异养微生物
化能异样微生物所需能量来源于有机物氧化产生的化学能，碳源主要是有机物，因此有时一种有机物可同时作为这类微生物的碳源和能源。根据它们利用有机物的特性，又可分为腐生性和寄生性，前者利用无生命活性的有机物作为生长碳源，后者则寄生在活细胞内，有相当一部分微生物可兼具这两种生活方式，如伤寒沙门氏菌等肠道致病菌。
（4）按细菌呼吸类型分（对氧的需求在后面具体介绍）
需氧、厌氧（还有严格的）、兼性厌氧
3、细菌的形态
①球菌：呈球形或椭圆形，大多数球菌直径为0.5-1μm；根据细胞分裂的方向及分裂后的各子细胞的空间排列状态不同,可将球菌分为以下几种:单球菌 、双球菌 、链球菌 、四叠球菌 、八叠球菌及葡萄球菌。具体见图
②杆菌：呈杆状或圆柱形；大多数杆菌直径与球菌相似，长约0.5-1.25μm，宽约0.7-8μm；
杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。一般情况下,同一种杆菌的宽度比较稳定,但它的长度经常随培养时间、培养条件的不同而有较大的变化。杆菌类型有长杆菌、短杆菌、球杆菌（菌体粗短呈卵圆形）、棒状杆菌 。
③螺旋菌：
根据其弯曲情况分为：弧菌、螺旋菌、螺旋体。
以下粉色字体可选讲。
弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形;
螺旋菌：螺旋满2—6环，螺旋状
螺旋体：旋转周数在6环以上，菌体柔软
4、讲完细菌形态后，出现两张图片，即细菌按照结构分的革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌。革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
可以简单介绍以下内容它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反：应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
过渡，因为细菌需要在显微镜下才能看到，而我们从平板上看到的是菌落，接着介绍菌落。
5、菌落
1）细菌与菌落区别
细菌：是一类具有细胞壁的单细胞，属于原核型微生物，必须借助显微镜才能看到。
菌落：单个细胞繁殖后，形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态结构的子细胞集团。并出现图片对照
2）、菌落形态从以下几方面描述
a.大小：<1mm为露滴状菌落,1-2mm为小菌落,2-4mm为中等小菌落,4-6mm大菌落,>6mm为巨大菌落。
b.形态：圆形、不规则状，假根状等。
c.隆起度：扩展，台状、低凸状、乳头状等。
d.菌落边缘：边缘整齐、锯齿状、毛刷状等。
e.表面性状：光滑、褶皱、同心环状等。
f.表面光泽：金属光泽、腊状等。
g.颜色透明度：透明、半透明、不透明等。
6、影响菌落特征的因素按照幻灯片讲解
7、细菌结构（着重强调芽孢）
1）、一般结构
（强调细胞壁，革兰氏染色结果不同是因为细菌细胞壁结构不同）
a、细胞壁：细胞最外层。起维持菌体固有的外形、屏障、耐受压力的作用。
化学成分主要由粘肽（共有的）、蛋白质、脂类等组成。
b、细胞膜：选择性渗透细菌体内外物质的交换，维持新陈代谢、参与呼吸作用
化学成分基本相同，由磷脂质、蛋白质、碳水化合物组成。
c、细胞质：是细胞膜包围着的部分，是细菌的基础物质、内在环境，是细菌合成蛋白质、核酸的场所。
基础成分是水、蛋白质、核酸、脂类
d、核质（质粒）：位于细胞浆内，控制着细胞新陈代谢、生长繁殖、细菌的遗传变异信息。
8、特殊结构简单介绍鞭毛、纤毛、荚膜
A、鞭毛：a、运动器官；b、弧菌、螺菌和假单胞菌类普遍长有鞭毛
B、荚膜：荚膜在生长过程中合成并分泌粘稠性物质堆积于细胞壁外， 若堆积物甚厚（0.2um以上），形成一定外形，界限清晰，性质稳定，称为荚膜。
C、纤毛：
纤毛与鞭毛的不同之处在于比鞭毛更细，数目更多；
分为普通纤毛和性纤毛两种。普通纤毛的功能为粘附作用，可使细菌细胞吸附在其他细菌和病毒、哺乳动物细胞或其它物体上。
着重强调芽孢，芽孢不是一种菌，它是细菌的一种休眠形式
D、芽孢：某些细菌在生活的一定阶段，能在体内形成一个特殊的休眠体。条件恶劣，或营养物质的缺乏特别是氮源或碳源或两者的缺乏，是诱发芽孢激活的重要原因。
芽孢形成过程：按照图的顺序
1）一个活菌，在恶劣条件下，核细胞聚集
2）在核周围有一层厚臂形成（孢子）
3）细胞分解，孢子释出
4）孢子释出
5）适宜生长条件下，孢子的膜胀破，新细胞形成。
强调：一个细菌只能形成一个芽孢，一个芽孢只能形成一个细菌营养体。
芽孢特点：细胞壁厚密，折光性强，不易着色（革兰氏染色空的），耐热性强，耐杀菌剂，不易杀灭，在高酸中不易萌发，酸性产品中一般不宜有芽孢杆菌。
9、细菌的繁殖
细菌是简单以二分列方式（裂殖）繁殖。
细菌的分裂过程：
首先是核的分裂和隔膜的形成
第二步横隔壁的形成
最后子细胞的分离

10、细菌生长周期
1）延缓期(Lag期)： 这是第一期，细菌体积增大，代谢活跃，但分裂迟缓，细菌繁殖极少，主要是为繁殖作准备。迟缓期是细菌进入新环境后的适应阶段，在此期中细菌合成和积累足够数量的酶、辅酶和某些中间代谢产物，以供繁殖所需。
2）对数生长期：经过迟缓期后，菌体细胞分裂程度剧烈上升， 细胞通过二分体裂解，一个变成两个，条件适宜时细菌呈对数增加。此期间细菌形态、染色、生物活性都很典型。
3）稳定期：细菌在一定量的培养基中生长时，随着营养物质的不断消耗、代谢产物的积累以及氧化还原电位等基质条件的改变，使细菌不可能按对数期的高速度持续生长。所以在对数期末，群体生长的速率逐渐下降，死亡速率开始增加，直至出现生长与死亡的动态平衡。
4）衰亡期： 持续的营养短缺和有毒代谢物使细菌开始减少，进入衰亡期的细菌常呈多形态、细胞大小不一或出现畸形。
11、霉菌：
霉菌为丝状真菌的统称，在分类学上分属藻状菌、子囊菌和半知菌。
霉菌的基本形态特征：
霉菌的菌体由分枝和不分枝的菌丝构成，许多菌丝交织在一起，称为菌丝体。
菌丝的形态：丝状真菌，一般多细胞，由营养体与繁殖体构成
结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、液泡、核糖及线粒体等按照结构图讲解
繁殖：霉菌有着极强的繁殖能力，而且繁殖方式也是多种多样的。霉菌主要依靠产生的无性或有性孢子进行繁殖。
霉菌的无性孢子繁殖：只是营养菌丝的断裂或繁殖菌丝分化形成无性孢子而产生同种新个体的过程。霉菌的无性繁殖主要通过无性孢子进行，常见的无性孢子类型有：
厚垣孢子：某些霉菌种类在菌丝中间或顶端发生局部的细胞质浓缩和细胞壁加厚，最后形成一些厚壁的休眠孢子，称为厚垣孢子。
孢囊孢子：在孢子囊内形成的孢子叫孢囊孢子。孢子囊是由菌丝顶端细胞膨大而成，膨大部分的下方形成隔膜与菌丝隔开，膨大细胞的原生质分化成许多小块，每小块可发育成一个孢子，根霉、毛霉等均可以以此种方式进行无性繁殖。
分生孢子：是在生殖菌丝顶端或已分化的分生孢子梗上形成的孢子，分生孢子有单生、成链或成簇等排列方式，分生孢子的形状、大小、结构、着生方式随菌种不同而异，可作为分类、鉴定的依据之一。
除此之外还有：节孢子、芽孢子等。
霉菌的有性孢子繁殖过程经过质配、核配与减数分裂三阶段获得单倍体的有性孢子。常见的有接合孢子、子囊孢子和担孢子。
接合孢子：由菌丝分化成两个形状相同、但性别不同的配子囊结合而形成的有性孢子叫接合孢子。
子囊孢子：菌丝分化成产囊器和雄器，两者结合形成子囊，在子囊内形成的有性孢子即为子囊孢子。
担孢子：菌丝经过特殊的分化和有性结合形成担子，在担子上形成的有性孢子即为担孢子。
霉菌菌落形态按幻灯片讲解
12、酵母菌：
个体形态、结构、繁殖按幻灯片讲解，
强调因为酵母菌是单细胞，所以生长周期同细菌相同。
讲完第33张幻灯片，即酵母菌菌落后，
时间在45-50min，休息10min
休息完毕上课
回顾：引导学员一起回答：
A、微生物分类、特点
B、细菌几种分类方法，
C、细菌的一般结构与特殊结构，重点是特殊结构
D、菌落概念
E、细菌的繁殖方式与生长周期
四、影响微生物生长繁殖的因素
1、包括营养 、气体、水、温度、酸度、渗透压及其他。
按照幻灯片讲解前六条
2、营养：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水分
3、水活度：各种微生物生长需要水活度不同，每种微生物体有其生长的最低、最佳、最高水分活度。酵母菌和霉菌可在低水分下生长，但是0.85是病原体生长的安全界限。0.85是根据金黄色葡萄球菌产生毒素的最低水分活度得来的。0.85以上水分活度食品需要冷藏或其它措施来控制病原体生长。水分活度0.60至0.85的食品为中等水分食品，这些食品不需要冷藏控制病原体，但由于主要酵母菌和霉菌引起的腐败，要有一个限定货架期。对大部分水分活度在0.6以下食品，有较长的货架期，也不需冷藏，这些食品称为低水分食品。
水分活度＜0.9，大部分细菌受到抑制
霉菌、酵母菌的孢子和芽孢抵抗干燥能力强
G+ ＞ G- c ＞ b
4、温度：在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高。也会死亡。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。但也常受其它环境条件的影响而发生变化。
种类 最低℃ 最佳℃ 最高℃
嗜热菌 40—45 55—75 60—90
嗜温菌 5—15 30—45 35—47
低温菌 -5—5 25—30 30—35
嗜冷菌 -5—5 12—15 15—20
5、酸度：大多数引起食品腐败的微生物易于在中性pH条件下生长，而酵母和酶菌以及一些细菌通常易于pH为3.0或更低的条件下生长。低pH一般不会杀死微生物但能抑制它们的增殖。致病菌不会在PH<4.5或更低的条件下生长。
PH≥4.6 低酸产品，适合一般微生物生长，包括病原菌和孢子。
PH<4.6 高酸产品，一般病原菌和孢子无法繁殖或萌发，致病菌通常不会在高酸性饮料中生长。
霉菌与酵母菌比较耐酸，应有效杀灭以防止产品的污染。如酸乳饮料
6、氧气：不同微生物对氧气需求不同，分为好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌和微需氧菌。
a、好氧菌：需氧，一般以空气作为氧的来源。实验室的平皿培养和斜面培养是最简单的好氧培养。菌体生长所需的氧气通过培养皿盖或棉塞缝隙从空气中获得。发酵罐培养一般采用将经过净化处理的空气强制通入培养基内，通过控制通气量和搅拌速度增加供养量。
b、厌氧菌、不需氧，氧对细胞产生毒害作用 厌氧培养法主要靠隔绝空气或驱除氧气的方式实现。实验室厌氧培养是可以把菌种接种到固体或半固体培养基的深层，并且在基质中加入一些硫基乙醇、硫代硫酸钠之类的还原剂，以造成缺氧和低氧化电位的环境，亦可在密闭的容器内依靠抽真空后填充无氧气体或化学吸氧剂（如焦性没食子酸）等方式除氧。工业厌氧发酵是在密闭的罐内，依靠菌体生长过程中将氧消耗，以达到厌氧的目的。
c、兼性厌氧菌：这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。
d、微需氧菌：只能在较低的氧分压（0.01~0.03bar，而正常大气中的氧分压为0.2bar）下才能正常生长的微生物。也通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。如霍乱弧菌、一些氢单胞菌属以及少数拟杆菌等。
7、渗透压：
a、产生原因不同浓度溶液被半透膜隔开，低浓度溶液的溶剂向高浓度溶液移动产生。
b、分类：等渗透压、高渗透压、低渗透压
c、不同渗透压微生物生长情况：
等渗透压（0.85-0.9％）生理盐水，一般细菌生长，
高渗溶液5-30％盐溶液，代谢活动呈抑制状态甚至死亡，如腌菜；
低渗溶液低于0.01%的NaCl溶液，微生物细胞吸水太多破裂也不生长。
五、实际需要控制的微生物
1、讲完渗透压后，过渡，学习微生物基础知识的目的是应用，即实即工作中我们液态奶产品需要控制什么样的微生物。我们要使产品无微生物，就需要控制原奶微生物，接着开始介绍需要控制的微生物，原奶微生物主要控制的是细菌总数、耐热芽孢、嗜冷菌。接下来分别介绍细菌总数、耐热芽孢、嗜冷菌。
2、细菌总数：
主要菌群：G+球菌，有微球菌、链球菌
产生的危害：大量的细菌繁殖会加快产酸，导致蛋白不稳定，从而缩短货架期
来源：
A、乳房中：小球菌属和链球菌属最为常见，其它棒状杆菌属和乳杆菌属等也可出现。
B、挤乳用具和盛乳容器：附着的细菌多为耐热球菌，还有八叠链球菌和杆菌。
C、乳链球菌：可能来自毛、粪、挤乳桶
讲完来源，出现两张图片，均为革兰氏染色后牛乳中球菌形态。
3、耐热芽孢：
主要：G+杆菌 （蜡状、枯草、乳杆菌、梭状芽孢杆菌、棒状杆菌）
危害：细菌营养体；有致病性；食物中毒
来源：饲料、水、尘埃、土壤。
以下可选讲：常见的耐热菌如下：
（1）芽孢菌属 芽孢菌属是乳中污染的主要的耐热菌种，常见于乳中的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，该类菌种为革兰氏阳性杆菌，需氧、可胨化牛乳，大多数菌落呈扩散性生长，菌落较大，表面呈灰白色，有的菌落成蜡样质颜色，一般不分解乳糖，在乳品中重要的芽孢菌是蜡样芽孢杆菌：一般在5～6℃下仍可生长，最佳生长温度为30～37℃，最高生长温度为37～48℃。最低生长pH为4.3～4.9，最高为9.3。
蜡样芽孢杆菌是许多食品的污染菌种，可引起人的食物中毒，当人体摄入含有大量活菌的食品时即可能引起呕吐、腹泻、肠绞痛等为主要症状的食物中毒，一般在食品中含有105～108个/g活菌时就可能引起食物中毒。极耐热，甚至可耐受121℃、1h的加热处理。
蜡样芽孢杆菌在乳中较少，一般小于10cfu/mL。在巴氏消毒乳和奶油中因低温储藏不易发生变化，在酸乳和其他发酵乳制品中因发酵产酸而使芽孢杆菌繁殖体很快被灭活或其生长受到抑制。
（2）梭状芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌是革兰氏阳性，厌氧性内生芽孢杆菌，芽孢的抗逆性较强，在无氧或微氧、营养丰富的条件下即可生长，生长温度为3～80℃，最适温度为25～40℃。该菌通常为过氧化物酶阴性，可发酵多种糖类。多数菌为非致病性菌，但也有一些菌体具有强的致病性。
原料乳中的污染菌数和种类较多，但梭菌对乳的污染较少，为10～102cfu芽孢/mL，当饲喂污染严重的青储饲料时乳中的芽孢数可达103cfu/mL以上， 乳制品中梭菌的主要来源是原料乳，多见于冬季，在青储饲料中检出率高，特别是劣质饲料。当原料乳中梭状芽孢杆菌数超过lcfu/ml时，则这种原料乳即不适宜于制作干酪。
（3）棒状杆菌 棒状杆菌是一类非运动性的革兰氏阳性杆菌，许多菌可生成色素，可液化明胶，还原硝酸盐，需氧，多为动物寄生性或病原菌，与乳业关系较大的菌是微杆菌属。在乳与乳制品中、加工厂设备器具等处检出率较高，为一种高度耐热的微小杆菌。该菌在固体培养基上生长良好，菌体呈团块成角或呈栏状排列。可发酵碳水化合物产生乳酸（L+乳酸），过氧化氢酶反应阳性，最适温度为32℃，有乳微杆菌和黄色微杆菌，可耐72℃、30min的加热，
4、嗜冷菌
主要： G-杆菌 （假单胞菌占50%）
危害：释放蛋白酶、脂肪酶；产生苦味；变质
来源： 挤奶、储奶设备；运输、加工、储藏污染；巴氏杀菌后污染
以下可选讲：
（1）嗜冷菌是指那些能在低于7℃时可以生长繁殖的细菌，虽然其理想生长温度为20~30℃，但在冷藏温度下仍可生长。这类细菌的大多数可被巴氏杀菌杀死，但菌体生长过程中产生的胞外酶却具有抗热性，可以在巴氏消毒乳中保留其酶活性，进而因酶的作用影响原料乳和终产品的风味和质量。
乳中最常见的嗜冷菌是革兰氏阴性杆菌(GNRS)，其中假单胞菌约占其总数的50％，而荧光假单胞菌则又是主要的优势菌种。此外，还有其他一些革兰氏阴性杆菌和某些可产芽孢的革兰氏阳性杆菌可在低于7℃下生长，如嗜冷菌革兰氏阴性杆菌：黄杆菌、产碱杆菌和色杆菌属等。
高温短时巴氏杀菌(HTST：72℃、15s)对一定微生物污染的原料乳实行杀菌时是可以基本将嗜冷性假单胞菌杀死的。
（2）嗜冷菌胞外酶 嗜冷菌不仅可在乳中生长，还可释放出许多可降解乳成分的胞外酶，包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酯酶、胞外多肽酶、糖酶，其中蛋白酶和脂肪酶了解较多，其他酶的资料还较少。尽管大多数嗜冷菌不是耐热的，但大多情况下分泌的胞外酶却可耐受巴氏杀菌温度(70～80℃)，甚至超高温(120～140℃)。嗜冷菌的代表菌株—假单胞菌分泌的蛋白酶和脂肪酶在加热77℃，15s，可保留酶活性60％～70％，在UHT加热温度140℃，5s后，可残留酶活性30％～40％。这些酶的耐热特性也因受到乳蛋白保护的影响而提高了稳定性。
①蛋白酶 在巴氏杀菌和UHT乳中耐热蛋白酶会导致产品的变质。
②脂肪酶 乳中脂肪水解不如蛋白水解明显，从荧光假单胞菌产生的脂肪酶与脂肪结合或形成脂酶多糖复合物。脂酶表现出的热稳定性比蛋白酶要低，然而，已发现它在130℃杀菌温度下仍能保持活力。
③嗜冷菌对乳与乳制品的影响 一般来说，巴氏消毒乳和UHT乳的保质期质量受其中蛋白酶、脂酶活动的影响。当原料乳在UHT杀菌前乳中的嗜冷菌菌数达到106cfu/mL时，杀菌后保质期中，不出20周即发生凝胶化。若菌数在107cfu/mL，将在2～10周即发生凝胶。并逐渐产生不新鲜风味或产生苦味。
5、控制措施：
可以熟记以下口诀
奶站车间卫生好，清洗消毒要做到；净化处理很主要，过滤能够除芽孢
巴氏杀菌不能少，超高温处要有效；管路严密无死角，产品质量绝对高
解释：（1）加强奶牛场和乳品加工厂的日常卫生管理，制定严格有效的卫生清洗消毒制度和措施。
（2）保证有效的预杀菌，可有效杀灭污染微生物和相关酶类，在奶牛场或加工厂对原料乳进行预巴氏杀菌(62～68℃，15s)以减低牛乳中的腐败菌和酶活性，但对乳成分和风味没有明显的变化，从而延长产品的保质期，提高了产品的品质。
（3）对原料乳进行有效的净化除菌处理，原料乳一般采用离心除菌和微滤除菌，前者可除菌90％，而后者可除菌99％以上。除去原料乳中的孢子。 （4）保证超高温灭菌的温度压力。
第一单元回顾：引导学员一起回答：微生物概念、特点、细菌分类、结构（一般结构与特殊结构，着重是特殊）、芽孢特点、细菌的繁殖方式、生长周期、影响微生物生长条件因素，与实际密切相关的，我们需要控制哪些微生物。

讲到分布广时插入以下案例
从检验方面来说，验证微生物分布广方法：
空气中有菌（空气净度）
水里（生活饮用水细菌、大肠）
人类（车间涂抹）等等
举例一个水杯，
水杯上可能有无数微生物，建议
每天使用前用开水冲
讲到适应性强，易变易举例
2003年爆发的非典型肺炎即
病毒变异

讲细菌分类时强调主要是按形态分与按细胞结构分，讲形态分类时注意引导学员，细菌间的相对位置也是一个重要的区分特征插入一张幻灯片（举例单球菌、双球菌、四连球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌）

讲到呼吸时，互动，
平板上菌落的呼吸类型（长在外面，内部）

讲菌落前提问
1人：营养琼脂平板上是细菌吗？
1人：细菌与菌落区别
1人：细菌菌落形态描述有几方面
教师解释逐一给出答案

讲到芽孢时提问，在芽孢的培养皿上挑取菌落做革兰氏染色，但是只看到杆菌，没看到芽孢，什么原因，让学员举手回答：如果学员回答不完整讲师补充

讲到影响菌落特征因素时举例：
一个检样的一个稀释度接种两个平板，一个平板琼脂量正常，另一个太少，结果会怎么样？引导大家回答，同时提醒以后注意

讲完芽孢，出一个小测试
提问2人，每人1题：不完整补充回答正确掌声鼓励
1、判断灭菌是否彻底，一般以芽孢是否被杀灭作为标准。
2、杀灭芽孢条件：
121℃ 、20分钟
160℃ 、2小时

讲完繁殖方式后出一个小练习
１个细菌２０分钟繁殖１代，１小时后有几个
讲完细菌生长周期提问：
1人，细菌在一定环境下能不能无限繁殖下去？
讲完生长周期做以下测试

依据上图细菌生长周期提问互动
1)BC段表示的是
答案：对数生长期，其形成的条件是营养物质充足、环境条件理想。
2)cD段表示的是稳定期其形成的条件是营养物质、环境条件有限。
3）、衰亡期对应图中 段
答案：DE段，该期的特点主要是 死亡率超过繁殖率、出现畸变、细胞解体等。

讲完酵母菌菌落后
休息10min

开始上课讲小笑话，使学员重振精神，然后回顾前面内容用时2-3min

讲到营养时举例：
营养琼脂中各成份作用
蛋白胨 氮源
氯化钠能维持均衡的渗透压；
琼脂是培养基的凝固剂。
讲到水活度时引导，为什么牛奶中容易长菌

讲到渗透压举例：
腌菜是利用高渗透压

讲到控制措施，举例现在的奶站的QACP管理就是降低微生物的最好控制措施，可大大降低原奶微生物。
提问1-2个人奶站关于卫生方面管理了解情况
例：1牛1巾
前三把奶弃去

第二单元
消毒、灭菌方法
48-57
20min
核心概念：清楚消毒、灭菌概念，不同情况选择不同的灭菌方式
必讲内容
一、消毒、灭菌概念
1、概念
1）、灭菌：杀死物体中所有的微生物（包括病原微生物和非病原微生物，芽孢和繁殖体）的方法。
2）、消毒：利用物理、化学和生物学等方法杀死物体中病原微生物的方法，对非病源微生物不能全部杀死。
3）、防腐：阻止或抑制微生物生长繁殖的方式，细菌一般不死亡。
4）、无菌：没有活的微生物存在。
2、对于消毒、灭菌来说，清洗是首要条件按照幻灯片图片讲解。
二、热力灭菌
1、方式：见幻灯片
2、灭菌原理
高温的致死作用，主要是由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂成分等。
3、湿热灭菌比干热好原因
（1）湿热灭菌时菌体蛋白质由于吸收水分较易凝固。
（2）湿热的穿透力比干热大。
（3）湿热灭菌时蒸汽与物体接触，凝结成水。放出潜热，提高物体温度。
三、化学消毒
1、化学消毒剂：见幻灯片
2、消毒剂作用原理
消毒剂使病原微生物蛋白质变性或凝固，发生沉淀。
破坏菌体的酶系统，影响病原体的代谢。
降低微生物表面张力，能破坏细胞膜的通透性，使细胞发生破裂或溶解。
3、紫外线灭菌原理
（1）灭菌机制：细胞内的核酸和蛋白质对紫外线具有强烈的吸收作用，（最大吸收峰分别为λ＝260nm和280nm），使这些生物大分子结构发生异常，从而造成细胞代谢机能发生障碍，导致细胞死亡，大剂量紫外线辐射可导致DNA断裂、缺失及形成链内或链间胸腺嘧啶二聚体，阻碍DNA的复制，导致微生物致死或变异。
（2）空气在紫外线照射下，会产生臭氧，臭氧是强氧化剂，也有一定的杀菌作用。
（3）作用范围：不能穿过普通玻璃，杀菌作用仅局限于物体表层，一般用于空气消毒、表面消毒。
以下选讲内容：
紫外线波长200-300nm者具有杀菌作用，其中以260-266nm最强。
革兰氏阴性无芽孢杆菌对紫外线最敏感。
一般每10—15m2面积安装30w紫外灯一支即可，消毒有效区为灯管周围1.5—2m。照射时间30分以上。经照射空气中的微生物可减少50%--75%。
回顾：串讲定义，干热灭菌与高压蒸汽灭菌的适用范围，常用化学消毒剂，紫外线灭菌
讲完第二单元休息10min

讲到清洗、消毒、灭菌时
举例：广告舒肤佳，爱心妈妈，呵护全家有一定道理，但有一定夸张

讲热力灭菌前
提问2人
1、目前化验室干热灭菌有几种
2、引导并提问：目前用湿热灭菌温度是否相同，原因
3、紫外线灭菌局限性

强调，湿热灭菌温度不同的原因，是由于含糖培养基在温度高时易分解

回顾时提问2人：
1人：消毒与灭菌区别
1人：湿热灭菌优点
不完整补充，其余回顾串讲

第三单元
检验准备工作
58-62
25min
必讲内容：1、玻璃器皿清洗。2、现场演示包扎。3、培养基的定义、制备注意事项。
一、玻璃器皿清洗及包扎
1、不同玻璃器皿应根据情况进行清洗
（1）新购进的玻璃器皿，均含有游离碱，故应先浸于2mol/L盐酸内浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。待干燥后，灭菌备用。
（2）使用过的玻璃器皿，未曾污染细菌时，尽可能立即用热的肥皂水或去污粉洗刷清洁，再用清水冲洗数次。
（3） 已污染的玻璃器皿，应先消毒再洗涮。被污染的吸管可浸于消毒液内24h再洗涮。污染的培养皿、试管可高压灭菌后再洗涮。
（4）附有油污的器皿，若用热的肥皂水不能洗净时，切不可用洗液浸泡，而应先用热的酒精、汽油或丙醇洗涤;或用氢氧化钠热溶液2（％）浸泡10-15分钟，然后再用稀盐酸洗一次，用水冲洗数次。油污如仍未除去，再重复以上手续一次。
（5）用于细菌染色的载玻片须放入肥皂水中煮沸10min，然后用毛刷沾肥皂水洗，再经清水洗净后浸入体积分数为95%酒精中。
2、现场玻璃器皿包扎演示
试管和三角烧瓶等的包装
试管管口和三角烧瓶瓶口塞上塞子,然后在塞子与管口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热或湿热灭菌。试管塞好塞子后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎。
强调包扎线的系法。
二、培养基分类及制备
1、定义：适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。它专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用。
1） 2、分类：
2） 1）根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。
天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、马铃薯、牛奶等。
２）根据培养基的物理状态来区分，可以分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。
３）根据培养基的用途来区分，可分为基础培养基、选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基等。
以下为选讲内容
a基础培养基：是其他培养基的基础，如营养琼脂
b选择培养基：在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而胆盐能抑制革兰氏阳性细菌的生长。
c鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。如伊红-美蓝琼脂培养基
d. 增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。
e.加富培养基：营养要求高的微生物，如血琼脂、BHI琼脂
e.厌氧培养基：常用的有庖肉培养基、MRS培养基
f.特殊培养基：如乳糖胆盐发酵管
g.生化实验培养基：用于微生物鉴定
二、培养基制备注意事项
1）容器的选择 ：配制及加热容器不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化，可放入大烧杯或三角瓶中置电炉上蒸煮溶化。
2）性状观察：液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此 ，配制好的培养基需观察性状，必要时采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。
3）pH要求：因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步验证并调正。
4）培养基灭菌 ：一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15--30分钟的方法。含糖培养基115°C高压蒸汽灭菌15-20分钟
5）培养基储存：培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。
回顾：不同玻璃器皿清洗方式，尤其注意被污染过的器皿的清洗；
培养基概念，制备注意其容器选择、性状、pH 、灭菌条件以及贮存。
上课前，简单回顾第一、第二单元内容，用时1-2min

提问1人：长菌平板如何处理

讲包扎前：讨论包扎目的
现场演示
分组：依据培训人员分3-5组进行器皿包扎演示，平皿12个1包，吸管单个包扎，三角瓶包扎

准备16张报纸
36套皿，5支1ml吸管，5支10ml吸管

5个三角瓶及胶塞

第四单元
微生物检验基本方法
63-71
20min
核心概念：微生物检验基本方法就是能够获得单个菌落或者能在显微镜下看到单独的细菌：
一、接种和培养
1）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种
2）纯培养：如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养
3）分离纯化：得到纯培养的过程
2、获得单个菌落的方法：涂布、划线、倾注
二、制片、染色、显微镜观察
1、染色
1）、细菌染色方法单染和复染，单染有苯胺黑染色和美兰染色；复染有革兰氏染色。
2）、染色目的：细胞与背景色差增大，轮廓清晰
3）革兰式染色原理： G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶