亚低温对缺血性脑卒中小鼠血脑屏障损伤保护作用_钟超超.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb，27（2）亚低温对缺血性脑卒中小鼠血脑屏障损伤保护作用钟超超，徐兴国，苗海航，乔峤，秦毅彬作者单位：南通大学附属医院麻醉科，江苏 南通226001通信作者：秦毅彬，男，硕士生导师，研究方向为围术期重要脏器的保护，Email：基金项目：南通市科技发展计划项目（MS12020026）摘要：目的 探讨亚低温对缺血性脑卒中小鼠血脑屏障的保护作用，寻找亚低温发挥保护作用的机制。方法 选取由南通大学实验动物中心提供的SPF级别雄性C57/BL6小鼠54只，分为假手术组（n=18）和卒中组（n=36），卒中组分为亚低温组（n=18）和常温组（n=18）。卒中组在行大脑中动脉阻塞手术后对亚低温组小鼠予以亚低温处理，在口腔温度监测下维持小鼠温度为（340.5），其他组术后均置于保温毯上正常复温。术后每日对各组神经功能进行评分，同时使用错步时间检测卒中后小鼠行为运动功能。于术后第3天处死小鼠，取梗死脑区行蛋白质印迹法（Western blotting）检测血脑屏障黏附分子紧密连接蛋白（ZO-1），紧密连接跨膜蛋白（Claudin-5）的蛋白表达以判断血脑屏障损伤的程度。结果 假手术组、亚低温组、常温组小鼠存活率分别为100%（18/18），94.44%（17/18），88.89%（16/18）。三组存活率比较，差异无统计学意义（2=53.72，P=0.122）。卒中组小鼠术后第1、2、3天神经功能评分 （2.80.2）、（2.6 0.3）、（2.40.3）分 明显高于假手术组 （0.6 0.04）、（0.5 0.03）、（0.4 0.01）分，差异有统计学意义（t=2.94，P0.001；t=2.86，P0.001；t=2.98，P0.001）；卒中组中，常温组小鼠术后第1、2、3天神经功能评分均明显高于亚低温组 （2.00.3）、（1.90.2）、（1.80.2）分，差异有统计学意义。卒中组小鼠术后第1、2、3天前后肢的平均错步比例（26.8%前、32%后；29.0%前、31.1%后；31.8%前、33.1%后）均高于假手术组（均为3%前、3%后），差异有统计学意义（2=29.05，P=0.002；2=28.76，P=0.003；2=26.42，P=0.005），且常温组小鼠术后第1、2、3天前后肢平均错步的比例高于亚低温组（16.6%前、16.9%后；18.6%前、17.9%后；20.8%前、19.9%后），差异有统计学意义（2=27.35，P=0.004；2=26.59，P=0.004；2=24.12，P=0.007）。存活的小鼠，脑卒中可以显著降低小鼠脑卒中脑组织中血脑屏障黏附分子ZO-1，Claudin-5的蛋白表达（t=2.54，P=0.001；t=2.46，P=0.003），亚低温处理组小鼠脑组织血脑屏障黏附分子ZO-1，Claudin-5的蛋白表达比常温处理组显著增高（t=2.48，P=0.003；t=1.68，P=0.043）。结论 脑卒中术后予以6 h的亚低温处理可降低卒中后小鼠神经功能评分，改善术后短期运动行为功能，减少血脑屏障的破坏。关键词：低温，人工；脑梗死；缺血性脑卒中；血脑屏障Protective effect of subhypothermia on bloodbrain barrier injury in mice with ischemic strokeZHONG Chaochao,XU Xingguo,MIAO Haihang,QIAO Qiao,QIN YibinAuthor Affiliation:Department of Anesthesiology,the Hospital Affiliated of Nantong University,Nantong,Jiangsu 226001,ChinaAbstract：Objective To investigate the protective effect of subhypothermia on bloodbrain barrier injury in mice with ischemic stroke,and to explore the mechanism of the protective effect of subhypothermia.Methods A total of 54 SPF-grade male C57/BL6 mice provided by the Experimental Animal Center of Nantong University were selected and divided into a sham-operated group(n=18)and a stroke group(n=36),and the stroke group was divided into a subhypothermia group(n=18)and a normothermic group(n=18).In the stroke group,mice in the subcritical group were treated with subcritical temperature after middle cerebral artery obstruction surgery,and the temperature of the mice was maintained at(340.5)under oral temperature monitoring,while all other groups were placed on a thermal blanket for normal rewarming after surgery.The neurological function of each group was scored daily after surgery,and the poststroke behavioral-motor function of the mice was also measured using staggered time.The mice were sacrificed on the third day after surgery,and the protein expression of ZO-1 and Claudin-5 was measured by western blotting to determine the extent of bloodbrain barrier damage.Results The survival rates of the sham group,subhypothermia group and normothermic groups of mice were 100%(18/18),94.44%(17/18),and 88.89%(16/18),respectively.There was no significant difference in the survival rate among the three groups(2=53.72,P=0.122).The neurological function scores on postoperative days 1,2,and 3 were significantly higher in the stroke group(2.80.2),(2.60.3),(2.40.3)than in the sham group(0.60.04),(0.50.03),and(0.40.01),with statistically signifi临床医学引用本文：钟超超，徐兴国，苗海航，等.亚低温对缺血性脑卒中小鼠血脑屏障损伤保护作用 J.安徽医药，2023，27（2）：337-340.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.02.028.337安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb，27（2）cant differences(t=2.94,P0.001;t=2.86,P0.001;t=2.98,P0.001).In the stroke group,the neurological function scores on postoperative days 1,2 and 3 were significantly higher in the normothermic group than in the subhypothermia group(2.00.3),(1.90.2),and(1.80.2),and the differences were statistically significant.In the stroke group,the average proportion of hind limb missteps before the 1st,2nd,and 3rd postoperative days was higher in the mice(26.8%forelimb and 32%posterior limb;29.0%forelimb and 31.1%posterior limb;31.8%forelimb and 33.1%posterior limb)than in the sham-operated group(both forelimb and posterior limb 3%),and the differences were statistically significant(2=29.05,P=0.002;2=28.76,P=0.003;2=26.42,P=0.005).The average proportion of hind limb missteps before the 1st,2nd,and 3rd postoperative days were higher in the normothermic group than in the sham-operated group(16.6%forelimb and 16.9%posterior limb;18.6%forelimb and 17.9%posterior limb;20.8%forelimb and 19.9%posterior limb),and the difference was statistically significant(2=27.35,P=0.004;2=26.59,P=0.004;2=24.12,P=0.007).In surviving mice,stroke significantly reduced the protein expression of ZO-1 and Claudin-5 in the brain tissue of mice with stroke(t=2.54,P=0.001;t=2.46,P=0.003),and the protein expression of ZO-1 and Claudin-5 in the brain tissue of mice treated with subhypothermia was significantly higher than that in the normothermic treatment group(t=2.48,P=0.003;t=1.68,P=0.043).Conclusion Subhypothermia treatment for 6 h after stroke surgery reduced the neurological scores,improved the short-term postoperative motor behavioral function,and reduced the damage to the bloodbrain barrier.Key words：Hypothermia,induced;Brain infarction;Ischemic stroke;Bloodbrain barrier缺血性脑卒中是全球致死致残的主要疾病之一，每年大约有600万人死于脑卒中1，然而治疗手段十分有限。目前经FDA批准的仅tPA治疗或血管内治疗，但都具有严格的时间窗限制，只有不足5%的急性脑卒中病人可以及时接受tPA再通治疗2-3。因此探究缺血性脑卒中损伤机制并对其进行干预显得极为迫切。亚低温4（3335）对缺血/缺氧性脑病、颅脑外伤等有确切的治疗作用，但是亚低温对缺血性脑卒中的保护作用以及保护机制仍然需要更多的研究。本研究通过对小鼠大脑中动脉阻塞60 min的模型进行亚低温处理6 h，观察小鼠术后3 d内的行为学变化，探讨亚低温对缺血性脑卒中的保护作用及其作用机制，为进一步应用于临床打下基础。1材料与方法1.1动物选择及分组SPF级别雄性C57/BL6小鼠54只，2325 g，由南通大学实验动物中心提供。小鼠分为假手术组（假手术组，n=18）和卒中组（n=36），卒中组小鼠行大脑中动脉阻塞手术建立缺血性脑卒中模型，术后分为亚低温组 （34.00.5），n=18 和常温组 （37.00.2），n=18。所有实验均经南通大学动物伦理委员会审批通过（审批号S20220210-008）。1.2建立模型卒中模型：用显微动脉夹暂时夹闭颈总动脉，将颈外动脉残端牵向外下方，使之与颈内动脉呈一条直线，在颈外动脉残端剪一小口，将长径为0.23 mm的8号线栓自颈外动脉插入颈内动脉，轻柔缓慢向前推进至遇阻力，将线栓与颈外动脉共同结扎以固定线栓，松开动脉夹，缝合切口。此时封闭了大脑中动脉开口，阻断了大脑中动脉的血流。大脑中动脉血流阻断60 min后暴露颈部切口，缓慢拔出线栓实现再灌注。假手术：仅进行暴露颈总动脉，颈内动脉，颈外动脉，电凝颈外动脉近端和远端并离断。1.3亚低温处理假手术组和常温组小鼠造模后立即置于烤灯（60 W）下复温，直至体温在（37.00.2）。亚低温组小鼠头部放置冰块局部降温，将口腔温度维持在（34.00.5），维持 6 h，后缓慢复温，直至体温维持在（37.00.2）。1.4观察指标及监测方法1.4.1口咽温将特制的温度探头置于小鼠的舌下，记录小鼠温度的变化，当小鼠温度偏离时，予以升温或降温处理。1.4.2神经功能评分采用动物行为学进行评分，0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向瘫痪侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1.4.3错步实验是一种在啮齿动物模型中确定中枢神经系统疾病的运动功能的工具。将小鼠放在钢格上（长径2.5 mm的杆，相距1 cm），记录小鼠每一成功放置脚位置的步数，一只爪子滑过钢格被认为是错步。确定每个爪的步数和错步数。错步实验百分比=错步/（步数+错步）100。1.4.4蛋白质印迹法检测将从每只大鼠收集的脑组织（100 mg）匀浆并在RIPA裂解缓冲液中裂解，然后使用 BCA 试剂盒（北京 TransGen Biotech Co.，Ltd.）进行分析以检测紧密连接蛋白（ZO-1），紧密连接跨膜蛋白（Claudin-5）浓度。将组织总蛋白加载到10SDS-PAGE凝胶上，并转移到硝酸纤维素膜上。用5脱脂乳封闭膜，然后在4 与一抗孵育过夜。然后将膜与二抗孵育，然后显色分析蛋白质印迹。1.5统计学方法应用Graphpad 6.0统计学软件进338安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Feb，27（2）行数据分析，正态分布的计量资料以x s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用成组设计的t检验；计数资料用率表示，比较采用2检验或校正标准差2检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1存活率共54只小鼠纳入研究，假手术组、常温 组 和 亚 低 温 组 存 活 率 分 别 为 100%（18/18）、94.44%（17/18）、88.89%（16/18）。亚低温组与常温组存活率比较，差异无统计学意义（2=53.72，P=0.122）。2.2神经功能评分于卒中术前1天，术后第1、2、3天进行神经功能评分。术前各组小鼠神经功能评分均为0分，差异无统计学意义。常温组术后第1、2、3 天神经功能评分明显高于假手术组（t=2.94，P0.001；t=2.86，P0.001；t=2.98，P0.001），卒中组中，亚低温组术后第1、2、3 天神经功能评分均明显低于常温组（分别为 t=1.68，P0.05；t=2.39，P0.01；t=1.67，P9.6fL可作为32周早产儿BPD发生的较敏感的预测指标。关键词：支气管肺发育不良；平均血小板体积；血小板参数；血小板；早产儿引用本文：史雨璇，殷其改.生后早期血小板参数与早产儿支气管肺发育不良的相关性分析 J.安徽医药，2023，27（2）：340-344.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.02.029.临床医学340