小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定.docx

小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定
【摘要】　目的： 体外建立小鼠小胶质细胞补体攻膜复合物亚溶破模型，并进行功能鉴定, 探讨补体攻膜复合物( sublytic membrane attack complex, sMAC ) 对中枢神经系统小胶质细胞的亚溶破刺激效应. 方法: 分离培养新生小鼠大脑皮层小胶质细胞, 用酵母多糖激活急性期患者血清制备补体优球蛋白 C56，以新鲜正常人血清 ( NHS ) 作为 C7～C9 来源，体外组装小鼠小胶质细胞 sMAC 亚溶破模型，CCK8 比色实验确定 sMAC 亚溶破剂量，激光共聚焦显微镜 ( LSCM )鉴定 sMAC 沉积.脱落细胞计数及台盼蓝拒染法分别判定细胞黏附力变化及脱落细胞活力. ELISA 法测定 sMAC 对小胶质细胞 NO 和 TNFα 分泌量的影响. 结果： 确定 C56 1∶480，NHS 1∶20 为小胶质细胞亚溶破补体量；LSCM显示sMAC 沉积于小胶质细胞表面； sMAC 刺激小胶质细胞后与对照组相比细胞脱落增加 ( )，而活力正常. 刺激后 12 h NO 及 TNFα 分泌量比对照组显着增加 (P　)，不同时相观察 sMAC 刺激后小胶质细胞 TNFα 分泌量均显着高于失活 sMAC (). 结论：　sMAC刺激小胶质细胞后分泌 NO 及 TNFα 增多，并且可降低小胶质细胞黏附力而不影响细胞活力，推测 sMAC 对小胶质细胞具有炎性刺激效应.

　　【关键词】 C56；补体攻膜复合物；小神经胶质细胞；显微镜检查，共焦；细胞活力; 一氧化氮；肿瘤坏死因子
　　0引言
　　补体系统是机体防御外侵的天然免疫屏障,由30余种血清蛋白组成，具有级联酶促和自我调节反应，可通过经典或旁路途径激活，形成膜攻击复合物产生杀伤效应. 对 MAC 的早期研究仅局限于对红细胞的溶破，后期研究显示，非致死量的 MAC结合到有核细胞可刺激细胞发生多种病理、生理变化，如产生氧自由基、细胞因子，诱导膜蛋白表达等，在多种疾病的发生和发展中发挥作用，该效应被称为补体攻膜复合物的亚溶破刺激效应［1］. 迄今，sMAC 对内皮细胞、淋巴细胞、肾小球细胞等多种有核细胞的刺激效应已有报道［2］，而对中枢神经系统中小胶质细胞的亚刺激效应至今报道甚少. 我们以原代小鼠小胶质细胞为靶细胞, 提取人血清补体优球蛋白,体外组装小胶质细胞 sMAC 亚溶破模型，并检测其炎性反应, 初步探讨 sMAC 对小胶质细胞的亚刺激效应.
　　1材料和方法
　　材料SPF级近交系 Balb/c 小鼠 ( 1~2 d ) 购自第三军医大学实验动物中心. 激光共聚焦显微镜 TCS NT 购于德国Leica仪器公司. 小鼠抗人MAC新抗原单克隆抗体 AE11，小鼠抗人 CD3 单克隆抗体UCHT1，CCK8试剂盒 (Dojindo日本)，NO 检测试剂盒 ，TNFα 检测试剂盒 (BD美国 )，急性期患者血清取自西南医院检验科；正常人血清取自10人以上义务献血员.

　　方法
　　小鼠小胶质细胞培养体外培养小鼠小胶质细胞,免疫组化鉴定小胶质细胞纯度， 95%方满足实验要求.
　　补体优球蛋白C56 的提取及活性鉴定急性期患者血清与 4 g/L 酵母多糖， mmol/L Mg2+37℃作用1 h后离心，取血清用微量补体反应性溶血法鉴定补体C56活性，收集活性样品用　mol/L PB (pH ) 透析，所得优球蛋白沉淀溶于含 100 g/L甘油的 mol/L PBS (pH ) 中，即为功能纯C56制品.
　　比色实验确定sMAC亚溶破剂量将小胶质细胞以 2×108 /(L・孔)接种于96孔培养板，漂洗后，每孔中加入含1 mmol/L EDTA无血清IMDM 养基100 μL,不同释度功能纯 C56 10 μL，37℃ 孵育 15 min，再加入1∶20 NHS，37℃ 孵育1 h组装 sMAC. 每孔中加入10 μL CCK8试剂，37 ℃ 30 min，于 450 nm 波长处测定A值.
　　鉴定sMAC小胶质细胞上的沉积 将2×104 小胶质细胞接种于自制盖玻片小室，生长至80%融合，漂洗，加入亚溶破剂量C56， 37℃ 15 min；再加入EDTANHS，冰上孵育60 min于细胞表面组装sMAC. 固定并封闭，加入小鼠抗人1∶10 sMAC单克隆抗体，同时设立小鼠抗人CD3 IgG 同型对照和不加一抗阴性对照，4 ℃过夜；FITC 标记的羊抗小鼠二抗，4 ℃ 1 h，漂洗后磷酸甘油封片，4 ℃避光保存，48 h 内用LSCM观察.
　　刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率细胞分为未刺激，sMAC，同浓度C56，1∶20 EDTANHS，失活sMAC共5组. 将C56与NHS于37℃提前混合孵育30 min，使sMAC失活. 各组细胞37℃孵育 24 h，收集温育液，离心，加少量培养液重悬，以计数板计算脱落细胞数，同时以台盼蓝拒染法，计算细胞存活率.
　　对小胶质细胞NO和TNFα合成的影响细胞分组同前，37℃孵育12 h，收集上清，离心后检测各组NO与TNFα分泌量.
　　统计学处理： 应用SPSS 软件处理，所有数据用x±s表示，组间采用t检验和方差分析，为统计学上有显着差异.
　　2结果

　　亚溶破模型的建立以人血清补体C56与NHS体外组装小鼠小胶质细胞sMAC亚溶破模型. CCK8比色法检测细胞溶破情况显示： 当C56稀释度1∶480时,sMAC活性升高，小胶质细胞溶破增多；当C56稀释度1∶480后, sMAC活性降低，小胶质细胞溶破减少. 故确立 C56 1∶480，NHS 1∶20 为小胶质细胞亚溶破补体量.

　　鉴定sMAC 在小胶质细胞表面沉积 以亚溶破剂量C56及EDTANHS体外组装sMAC，LSCM 观察可见细胞膜表面 sMAC 沉积明显，同时小胶质细胞膜完整性好，形态无明显变化，提示所加入的sMAC是亚溶破剂量的sMAC.
　　图1激光共聚焦显微镜鉴定sMAC组装LSCM ×200
　　刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率亚溶破剂量sMAC刺激细胞24 h后，细胞脱落增多 ()；台盼蓝染色见sMAC刺激后脱落细胞大多数为存活细胞，其余对照组则大部分为死亡细胞.由此推断，sMAC可降低细胞黏附力，而不影响细胞活力.
　　表1sMAC 刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率
　　vs 未刺激组、C56单独组、EDTANHS组和失活sMAC组.
　　亚溶破sMAC对小胶质细胞NO和TNFα合成的影响5 组小胶质细胞37℃孵育12 h后ELISA检测上清中NO与TNFα分泌量. sMAC刺激后小胶质细胞分泌NO与TNFα显着增高，同各对照组相差显着(，图 2）.
　　vs未刺激组、C56单独组、EDTANHS组和失活sMAC组.
　　图2sMAC对小胶质细胞分泌炎性因子NO与TNFα的影响
　　3讨论
　　MAC作为补体激活的终末因子，对不同细胞可产生不同效应，其对细胞的杀伤功能主要取决于C9 结合量，CD59分子可通过阻碍C9的聚集而调控MAC的组装，是重要的补体膜调节蛋白［3］，同时，有核细胞可通过内吞等方式将MAC清除，防止细胞溶破. 补体在进化过程中存在高度保守性，同种和异种间补体可相互作用，产生不同的刺激效应. 如Adler等［4］以NHS和C56分子在大鼠肾小球系膜细胞上组装sMAC, 刺激细胞活化产生活性氧自由基；Halperin等［5］证实人sMAC可促进小鼠3T3细胞细胞有丝分裂和再生增加. 我们采用不同浓度人补体C56与NHS中C7～C9 成分体外确定了小鼠小胶质细胞sMAC亚溶破剂量，LSCM验证sMAC小胶质细胞的沉积，成功建立了小胶质细胞sMAC亚溶破模型，为后续功能实验奠定了基础.

　　sMAC可促进单核/巨噬细胞脂质代谢增强, 炎症介质和氧自由基大量释放，早期可防御外侵、维持内环境稳定，而后期则对机体产生损伤.小胶质细胞是髓系来源的CNS单核细胞，对神经系统炎症修复及免疫调节起重要作用. 我们用sMAC刺激小胶质细胞后观察细胞脱落和活力改变，结果示sMAC能使细胞脱落增加而活力不受影响，说明sMAC可降低小胶质细胞的黏附功能，其机制可能为改变细胞外基质成分，对细胞骨架重排的结果［6］. sMAC刺激小胶质细胞12 h后检测到细胞分泌炎性介质NO和TNFα增加，其余对照组中， EDTA抑制补体活化不产生MAC， C56单独无炎性刺激效应；37℃孵育下补体C7～C9, S蛋白与C56可直接结合形成失活sMAC，不能与细胞结合，各组均无明显刺激效应.

　　NO和TNFα是CNS炎性病变中重要的致炎因子，NO具有神经毒性，可导致神经元的损伤和死亡，TNFα能自分泌促进白细胞浸润，也可上调神经元 MHCⅠ表达，更易受毒性T细胞攻击；并且 TNFα的分泌可进一步诱导小胶质细胞 NFκB和 PKC通路活化，释放NO,花生四烯酸等介质促进炎性爆发［7-8］. 本研究显示sMAC在CNS炎症的早期阶段可能对小胶质细胞有炎性刺激效应，为今后探讨补体在CNS炎性疾病中的发病机制提供了线索，但就其信号传导途径尚待进一步研究.
　　【参考文献】
　　［1］Cole DS, Morgan BP. Beyond lysis: How complement influences cell fate［J］. Clin Sci, 2003,104 (5):455-466.
　　［2］Rus H, Cudrici C, Niculescu F. The Role of the Complement System in Innate Immunity ［J］. Immunol Res, 2005,33(2):103-112.
　　［3］He C, Imai M, Song H, et al. Complement inhibitors targeted to the proximal tubule prevent injury in experimental nephrotic syndrome and demonstrate a key role for C5b9［J］. J Immunol， 2005,174(9):5750-5757.
　　［4］Adler KS, Baker PJ. Johnson RJ, et al. Complement membrane attack complex stimulates production of reactive oxygen metabolites by cultured rat mesangial cells［J］. J Clin Invest, 1986,77,762-767.
　　［5］Halperin JA, Taratuska A, NicholsonWeller A. Terminal complement complex C5b9 stimulates mitogenesis in 3T3 cells［J］. J Clin Invest，1993,91,1974-1978.
　　［6］郭啸华，廖立生. 补体攻膜复合体致肾小球脏层上皮细胞黏附性改变研究［J］.细胞生物学杂志，1999,21(3):128-132.
　　［7］Nguyen VT, Bemvenisite EN. Critical role of tumor necrosis factorα and NFκB in interferonγinduced CD40 expression in microglia/macrophages［J］. J Biol Chem, 2002,277(16):13796-13803.