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反相离子对高效液相色谱法测定祖卡木颗粒中吗啡的含量
【摘要】 目的 建立祖卡木颗粒中吗啡的含量测定方法。方法 以Hypersil BDS C18柱( mm×250 mm,5 μm)为色谱柱，流动相： mol/L磷酸二氢钾、 mol/L庚烷磺酸钠混合溶液乙腈三乙胺，体积分数为5%的冰醋酸调pH值为；流速： mL/min；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。结果 吗啡的线性范围为～ μg/mL，r=,平均回收率为％，RSD=％。结论 本文建立的方法简便，测定结果准确，重复性好，可用于该制剂中吗啡的含量测定。
【关键词】 祖卡木颗粒；吗啡；反相离子对色谱
　　Abstract:Objective To set up an ionpair RPHPLC method for determining the content of morphine in Zukamu　The analysis was performed on an Hypersil BDS C18 column ( mm×250 mm,5 μm). The mobile phase was a mixture of　mol/L potassium dihydrogen phosphate and　mol/L sodium heptanesulfonateacetonitriletriethylamine，adjusted with 5% glacial acetic acid to pH　The flow rate was　mL/min and the detection wavelength 240 nm. Results The linear range of morphine was ～ μg/mL. The average recovery was ％ with RSD ％. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible and can be used for the determination of morphine content in Zukamu granules.
　　Key words:Zukamu granule；morphine；ionpair RPHPLC
　　罂粟壳为罂粟科植物罂粟Papaver somniferum L.的干燥成熟果壳，其主要成分为吗啡(morphine)、可待因(codeine)、蒂巴因(thebaine)、那可汀(narcotine)、罂粟壳碱(narcotoline)和罂粟碱(papaverine)；另含多糖约%，水解可得乳糖等多种成分。

　　祖卡木颗粒由山柰、睡莲花及罂粟壳等多味中药制成，罂粟壳中吗啡成分的含量较高，吗啡具有镇痛、止咳、止喘等功效，为本方有效成分之一，但人体摄入吗啡过量，可使人产生依赖性及神经精神疾病，因此需要控制其含量。为了提高制剂的质量控制水平，本文参考中国药典［1］和文献［2］，在祖卡木颗粒质量标准研究中，研究制定了高效液相色谱法测定吗啡的含量，以控制药品的质量。
　　1 仪器与试药

　　LC10AT高效液相色谱仪，HW2000色谱工作站，BDS C18柱，超声清洗器。乙腈，水为超纯水，其他试剂均为分析纯，吗啡对照品，祖卡木颗粒。
　　2 方法与结果
　　色谱条件

　　色谱柱：Hypersil BDS C18柱，流动相： mol/L磷酸二氢钾、 mol/L庚烷磺酸钠混合溶液乙腈三乙胺，体积分数为5%的冰醋酸调pH=；流速： mL/min；检测波长：240 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。理论塔板数按吗啡峰计算不低于3 000。
　　对照品溶液的制备

　　取吗啡对照品适量，105 ℃下干燥1 h，精密称定，置棕色量瓶中，加流动相制成每1 mL含 μg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。
　　供试品溶液的制备

　　取装量差异项下的内容物，研细，精密称定约 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加氨试液10 mL，待样品粉末充分润湿后，加三氯甲烷50 mL，振摇5 min，超声提取70 min；移置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤锥形瓶，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，碱液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，置水浴中挥去三氯甲烷；残渣用少量流动相溶解，移至10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，静置，用 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
　　阴性样品溶液的制备

　　取不含罂粟壳的阴性样品，按“”项下方法制成阴性样品溶液。
　　干扰试验

　　分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液20 μL，按“”项下色谱条件进样，三者的色谱图表明阴性样品溶液在吗啡保留处无吸收峰，处方中其他组分对吗啡的含量测定无干扰，见图1。
　　A.对照品 B.样品 C.阴性样品
　　图1 祖卡木颗粒的HPLC谱图
　　HPLC chromatograms of Zukamu granules
　　线性关系

　　分别精密吸取吗啡对照品溶液1、2、3、4、5、6、8、10 mL置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别取20 μL进样，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品质量浓度(ρ)为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程：A=8 ρ+1 ，结果表明吗啡质量浓度在～ μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
　　精密度试验

　　取吗啡对照品溶液连续进样5次，每次20 μL，按上述色谱条件测定峰面积，结果峰面积分别为457 597、455 700、458 374、459 938、460 905，RSD为％，结果表明精密度良好。
　　稳定性试验

　　取同一批供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样，进样量均为20 μL，按上述色谱条件测定峰面积，测得供试品中吗啡峰面积值分别为340 860、335 796、337 715、329 813、334 931，RSD为％。结果表明供试品溶液在8 h内稳定。
　　重复性试验

　　取同一批号的祖卡木颗粒，按“”项下方法分别制备5份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，吗啡平均含量为 4 mg/g，其RSD=%。结果表明方法重复性良好。
　　回收率试验

　　取已知含量的样品(批号0602252， μg/g)6份，每份约 g，精密称定，置100 mL具塞三角瓶中，分别精密加入吗啡对照品溶液( μg/mL)1 m L，按“”项下供试品溶液制备方法，自“加氨试液10 mL……”起，制备加样供试品溶液。按上述色谱条件测定吗啡含量，测得平均加样回收率为％，RSD=％。结果见表1。
　　表1 吗啡回收率试验结果
　　Results of recovery test(n=6)
　　样品含量测定

　　取4批祖卡木颗粒样品按“”项下方法处理，取处理好的制剂样品溶液，进样20 μL，计算每批样品的含量，结果见表2。
　　表2 样品测定结果
　　Morphine content of the sample
　　3 讨论
　　提取方法的选择

　　考察了固相萃取法和溶剂萃取法，固相萃取法由于各固相柱间差异，操作上重现性不好，导致测量结果不稳定，并且固相柱成本较高，后改为溶剂萃取法。先后比较了用醋酸乙酯、甲苯、乙醚、三氯甲烷等作为萃取的有机相，结果以三氯甲烷效果最好。碱化试剂考察了氨水和氨试液，结果发现用氨水碱化提取效果很不好，而用氨试液效果较好。按“”项下方法制备供试品溶液，分别考察了冷浸法和超声法，结果表明超声提取法提取效率高。超声法考察了超声时间，分别超声50、60、70、80、90、100 min提取；结果以超声70 min最好。
　　色谱条件的选择

　　按“”项下方法制备吗啡对照品溶液，在紫外分光光度计上进行扫描测定，同时参照中国药典［1］及有关文献［3］，选择240 nm为检测波长。

　　流动相考察了药典方法［1］、醋酸铵三乙胺甲醇体系［4］，KH2PO4CH3CNNaSO3C7H15体系等。通过试验比较最后确定以KH2PO4CH3CNNaSO3C7H15体系最好，因为在流动相中加入庚烷磺酸钠作为反离子试剂，可以与吗啡形成离子对化合物［5］，有利于其在固定相上的保留和分离。又进一步考察了流动相各组分比例、三乙胺加入量和流动相的pH值。最终确定“”项下色谱条件。
【参考文献】
　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：256-257.
　　［2］ 杨秀伟.生物碱［M］.北京：化学工业出版社，2005：213-218.
　　［3］ 王刚，常寿元.HPLC测定力神止咳糖浆中吗啡的含量［J］.中成药，2001，23(4)：289-290.
　　［4］ 郝红艳，郭济贤，顺庆生，等.HPLC和HPCE法测定罂粟壳中3种生物活性生物碱［J］.药学学报，2000，35(4)：289-293.
　　［5］ 刘文英.药物分析［M］.5版.北京：人民卫生出版社，2004：312-313.