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AIDS的实验诊断 【关键词】 获得性免疫缺陷综合征；人类免疫缺陷病毒；实验室技术和方法获得性免疫缺陷综合征又称艾滋病，已成为危害全球的一种严重传染性疾病，是由人类免疫缺陷病毒引起的。艾滋病在我国的流行已经进入快速增长期，预防和控制艾滋病已经刻不容缓1。因此对HIV抗原抗体的检测，尽早发现感染者控制其传播是非常重要的。目前临床检测内容主要有P24抗原、HIV抗体、HIV病毒载量和CD4+T淋巴细胞计数等。现就HIV的实验诊断方法作如下简述。1 HIV的结构特点 HIV呈球形或卵形，直径90130nm，包膜由病毒特有的蛋白质附着于一薄层类脂质构成。其核心含有两条相同拷贝的RNA链，其外周是由多种蛋白质形成的核膜。HIV同其它逆转录病毒一样，基因组中存在三个大的开放读框，其顺序是gag-pol-env。Gag基因编码55KD的前体蛋白，在病毒成熟过程中，被pol基因编码的蛋白酶加工，分别产生核心蛋白P17、核壳蛋白P24和核酸结合蛋白P15。P24是核壳组成蛋白，构成病毒的核衣壳，它的结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。在HIV-2与P24对应的是主要核心抗原P32，为HIV-2型病毒感染的特异标志。Env编码包膜蛋白，由外膜糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41组成2。2 HIV抗原检测 在感染早期，HIV抗体尚未出现，而血24抗原常以低水平出现，因此检测P24抗原可作为早期特异性诊断；该抗原检出率远比HIV抗体为低，因为HIV抗原出现不久即可产生抗体，抗原抗体以复合物形式存在，而游离很少，抗原在感染后期再度升高作为HIV活动性感染的标志。因此，P24抗原检测主要作为HIV抗体检测“窗口期”的诊断，同时对监测病程进展和预后判断、判定新生儿感染母婴垂直传播可能性、疗效评价、评价新疫苗、艾滋病的研究等方面有重要意义3。 P24抗原检测方法有酶联免疫吸附试验、放射免疫、免疫荧光技术、免疫吸附电镜等，其中ELISA最为敏感。其原理是用已知抗体包被固相载体，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与抗体结合形成复合物，再加入酶标记抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪读取结果。此法易受干扰物质影响产生假阳性，因此需用综合实验加以鉴别。由于HIV感染早期P24抗原量很少且病情发展过程中抗原抗体形成复合物阻碍P24抗原检出，另外，方法灵敏度不高也影响检出率。 新技术的应用，提高了P24抗原检出率，主要有：免疫复合物裂解检测法，利用弱酸可使免疫复合物解离，增加P24抗原浓度，从而提高阳性检出率，其敏感性90%4。但不宜单独使用，可用于细胞培养中HIV测定，抗HIV药物疗效测定，或急性HIV感染检测时替代HIV-RNA检测。超敏感酶免疫测定法，又称双位点免疫复合物转移酶免疫测定，基本原理是利用高亲和力抗体浓缩富集24抗原进行检测。此法对试剂仪器要求较高，操作复杂。ISEM，将抗原抗体的特异性与电子显微镜的高分辨率相结合，对病毒颗粒直接特异性检测。此法灵敏度高，需精密仪器，操作复杂。线性免疫酶测定和Cobas core HIV Combi EIA属新近发展起来的第四代HIV检测技术5。3 HIV抗体检测ELISA ELISA作为HIV抗体初筛最常用的检测方法，其实验用试剂在经历了第1代、第2代、第3代后，已经发展到第4代6，7。1985年美国FDA批准使用的第1代ELISA检测试剂，主要是以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，由于含有宿主细胞成分的污染和杂蛋白的存在，故假阳性率较高。1990年第2代试剂使用了基因工程的重组或人工合成多肽HIV抗原包被反应板，抗原组成一般包括P24、gp36、gp41、gp120能同时检测HIV-1、HIV-2型，其特异性较第1代试剂有了很大的提高。1992年美国研制出第3代试剂，使用双抗原夹心法检测抗体，相对第2代试剂敏感性有所提高，由于其检测亚型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亚型，并且同时能检出IgM抗体，因此窗口期由10周可以缩短至34周。为避免窗口期传染，荷兰、法国等国已研制出第4代试剂，于1998年在欧洲注册使用。它是在第代的基础上进一步增加了P24抗原的检测。同时进行HIV抗体及P24抗原的检测，可以提高试剂敏感性，缩短窗口期，一般为414天左右，减少急性感染者窗口期漏检8。据文献报道9，由于急性病人病程中存在从血清24抗原降低到抗体升高的“第2窗口期”，此时抗原抗体浓度均低于试剂检测限，结果为阴性。因此应选择敏感的的检测试剂，避免“第2窗口期”。另据报道10，第4代试剂虽然缩短窗口期，但其特异性却比第三代略低。因此还要进一步提高敏感度。明胶颗粒凝集实验 它是通过包被了HIV抗原的颗粒凝聚来检测HIV抗体，用明胶制成的颗粒作为载体，加入预先稀释的样本，经抗原致敏的明胶颗粒作实验孔，未致敏的明胶颗粒作阴性对照孔，样本中有抗HIV存在时，可与抗原致敏的颗粒发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝聚情况判读结果。PA是一种快速、简便的筛查实验，很适合对少量标本的检测，其灵敏度和准确性不如ELISA法。金标快速反应试验 它将颗粒凝聚法的简便性和酶免疫测定技术相结合，用于快速检测抗-。一般采用醋酸纤维素膜作固相载体，用红色胶体金A蛋白取代酶标抗体，在载体下面有吸水衬垫可吸收加入的待检样本溶液。将重组或合成HIV肽抗原包被在载体上，加入待检血清，包被抗原和被检血清中抗体结合，样本中有抗-HIV时，则薄膜上就会产生一橘红色斑点，一般310min出结果，特异性较好，试剂稳定，检测时不需要任何设备，快速简便，适用于应急检测以及边远地区检测。免疫印迹试验 WB被称为抗-HIV检测的“金标准”，它的原理是将HIV病毒蛋白通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳把分子量大小不等的蛋白带分离开来，再把这些已经分离的不同蛋白转移到醋酸纤维素膜上，再将此膜切割成条状，每一条醋酸纤维素薄膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。待检血清样本用稀释液稀释成1100，把它直接加到醋酸纤维素膜上，恒温振荡，使其充分接触反应。血清中若含有抗-HIV，就会与膜条上的抗原结合，冲洗除去多余的抗体，再加入抗人-IgG酶结合物并孵育，经洗涤后加入底物，有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果。据文献报道3WB特异性为%。其他方法 艾滋病唾液检测卡、家庭HIV检测、尿液HIV抗体检测。4 HIV病毒载量检测 HIV病毒载量是指体内病毒复制的数量，一般以血清HIV-RNA表示，随着生物技术的发展，HIV病毒载量检测得到人们越来越多的重视，它可以直接检测HIV-RNA，可在发现血清学变化之前检测HIV感染，而且比24抗原检测方法更灵敏，主要以的拷贝数表示。其检测意义在于：早期辅助诊断：可在其他血清学和病毒学标志出现前检出病毒核酸使窗口期缩短6天。也可判定无症状，而血清阴性患者潜在的HIV传染性；用于预测疾病病程和监测抗病毒治疗的疗效与病毒水平；用PCR检测HIV-RNA可判定婴儿出生后18个月内，他们血液中的HIV-IgG抗体是否为来自于母体的HIV-IgG抗体，婴儿是否被感染上HIV11。PCR检测法 PCR技术基于对RNA逆转录酶的作用，使病毒RNA逆转录为CDNA，随后进行多聚酶链反应，扩增DNA片段，使其达到可检测的含量。传统的PCR技术比较简便、快捷，但是容易出现假阳性，另外，HIV基因多样性，没有一套引物可覆盖所有HIV序列，使检测敏感性受到限制。从而限制了PCR临床诊断HIV以及用于高危新生儿感染检测。 实时荧光定量PCR技术虽在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，特异性更强，有效地解决了PCR“污染”问题，自动化程度高等特点，目前得到广泛应用。该方法可以检测血浆病毒载量，也可以检测血液中单个核细胞的前病毒载量。一般来说，前病毒载量与血浆病毒载量平行，具有相关性12。分枝信号扩增检测法 该方法是通过将捕捉到的病毒基因信号扩增直接检测RNA，即从HIV中提取分离RNA，与靶探针杂交抽取RNA，再通过另一部分靶探针使支链DNA分子与RNA结合，利用化学发光原理进行扩增信号，发光强度与HIV-RNA含量呈比例关系。bDNA可测出单个拷贝的HIV，实际灵敏度可测出约每毫升10000个HIV，其改良方法可达每毫升500个HIV左右。耗时较长，约20且过夜，bDNA不存在扩增物的交叉污染。可以检出所有亚型，敏感度稍低13。核酸序列扩增实验 NASBA又称自主序列复制系列或再生长序列复制技术，是以RT-PCR为基础，但它无需将逆转录和扩增分两步进行，它是一个扩增的酶系统，包括RT酶、RNaseH和T7RNA聚合酶模拟病毒RNA在细胞内复制过程，产生大量拷贝的片段，现在证明NASBA是在HIV感染早期阶段对血液中HIV-1病毒检测的非常灵敏的方法。如果将NASBA与荧光相关光谱FCS连用还可以对HIV-1RNA进行在线检测。这是预测病情变化和监测抗病毒疗效非常重要的指标。5 基因芯片技术 HIV基因芯片技术是把PCR技术和核酸分子杂交技术完美结合。是在厘米见方的固相载体上，将基因以微点阵的形式排列，应用核酸杂交的原理来检测未知基因，具有操作简单、自动化程度高、检测靶分子种类多、成本低、结果客观性强等特点14。1996年底，Kozal等研制出一种DNA芯片，对HIV-1逆转录酶及蛋白酶的基因突变进行筛选，并跟踪监测HIV拮抗药物的产生和突变，疾病相关基因型以及监控患者在治疗中的反应。1998年Hauser等应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测HIV，对艾滋病的早期诊断有十分重要的意义。HIVPRT440也已广泛用于HIV-1病毒的测序、分型及多态性分析15。因此，基因芯片在鉴定HIV感染实验诊断中具有广泛的应用前景。6 CD4+T淋巴细胞计数 CD4+T淋巴细胞是人体免疫系统最重要的细胞之一，HIV主要侵犯CD4+淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤。而CD4+淋巴细胞其辅助功能不仅可以促进CTL的激活，而且也引起细胞的抗体分泌16，所以，HIV感染者的病程进展速度与CD4+细胞计数的下降程度密切相关。CD4+淋巴细胞计数是AIDS诊断，疾病分期，制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的实验室标准指标。目前对CD4+淋巴细胞计数有手工操作法和自动检测法，手工检测常用荧光标记的特异性抗CD4+细胞单克隆抗体检测。流式细胞仪是目前最好的自动检测方法，可得出CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的绝对值及占淋巴细胞的百分率。7 病毒分离培养 人体感染病毒后，便会终生携带。HIV广泛存在于人体的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、组织、血液和其他体液中，从这些材料中分离培养HIV，可用于HIV感染的辅助诊断，以及研究HIV在人群中的分布、变异和耐药情况。HIV病毒分离需要在P3级生物安全实验室进行，实验条件要求高。【参考文献】 1 胡飞跃.中国艾滋病预防控制的政策研究J.国际技术经济研究，2003，6：40-45. 2 李素敏，王润田，赵云珠.输血相关HIV感染的免疫学检测进展J.中国输血杂志，2004，17：204-206.3 Mylonakis E，Paliou M，Lally M，etand treatment of AIDS J.Am J Med，2000，109：568-576.4 肖建春，赵之伟，赵启唐.HIV P24抗原检测技术的研究进展J.国外医学：病毒学分册，2003，10：111-114.5 魏民，邵一鸣.HIV实验室研究进展和发展趋势J.国外医学：病毒学分册，2003，10：65-69.6 Dowdetection early of AIDS J.Transfuse Med，2001，10：97-106.7 Gurtler L，Muhlbacher A，Gichl U，etevaluation of a new automated fourth-generation human immunodeficiency virus screening assay with a sensitive antigen detection module and high specificity J.Clin Microbioc，2002，40：1938-1946.8 尚红.艾滋病检测中值得重视的几个问题J.中华检验医学杂志，2003，26：261-262.9 Weberscreening asswy with a sensitive antigen detection module J.Clin Virol，2002，25：357-359.10 张麒，佐拉，秦光明，等.评估第4代酶联免疫法诊断试剂对静脉吸毒者感染窗口期的检测能力J.中华检验医学杂志，2006，29：631-633.11 沈霞.艾滋病的实验室诊断J.中华检验医学杂志，： -.12 ODoherty U，Swiggard 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