金黄色葡萄球菌检测.pdf

食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB 4789.10-2010GB 4789.10-2010 北京陆桥技术股份有限公司北京陆桥技术股份有限公司技术服务电话：[phone]技术部邮箱：L销售服务电话：[phone]北京陆桥技术股份有限公司目 录金黄色葡萄球菌的卫生学意义金黄色葡萄球菌的生物学特性2010版国标的主要修订内容金黄色葡萄球菌的检测方法北京陆桥技术股份有限公司 金黄色葡萄球菌作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶和肠毒素。金黄色葡萄球菌的卫生学意义北京陆桥技术股份有限公司革兰氏阳性球菌，直径为0.51.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如串状葡萄，故称为葡萄球菌。金黄色葡萄球菌无芽胞、无鞭毛，大多数无荚膜。金黄色葡萄球菌的生物学特性北京陆桥技术股份有限公司 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH7.4。普通营养琼脂平板上形成湿润、光滑、有光泽、圆形凸起的菌落，直径1-2mm。在培养初期呈灰白色，2-3天后，可呈现金黄色，也可能有白色、黄色或桔色菌落。大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化。金黄色葡萄球菌的生物学特性北京陆桥技术股份有限公司2010版与2008版的区别2010版主要修改如下：2010版主要修改如下：合并了GB/T 4789.10-2008和GB/T 4789.37-2008的内容。修改了标准的中英文名称和适用范围。完善了计算公式二及系数1.1的解释。修改了附录A中胰酪胨大豆肉汤的名称，规范为10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤。删除了“第三法 金黄色葡萄球菌PetrifilmTM 测试片法”。北京陆桥技术股份有限公司定量方法定量方法定性方法定性方法MPN法平板计数法增菌培养法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验。2010版GB检测方法及适用范围北京陆桥技术股份有限公司 GB 4789.10-2010 定性检测北京陆桥技术股份有限公司样品处理：25g样品+225mL 7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，于无菌均质杯或均质袋中，均质混匀。361培养18-24h。GB 4789.10-2010 定性检测北京陆桥技术股份有限公司7.5%氯化钠肉汤原理：原理：蛋白胨、牛肉粉在培养基中作为基础营养物质，为细菌生长提供所需的氮源、碳源及其他的营养元素；高浓度的氯化钠起到选择性，不能耐受高盐环境的细菌在该培养基上生长受到抑制。10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤原理：原理：胰酪胨、大豆蛋白胨作为基础营养物质，为细菌生长提供所需的氮源、碳源及其他营养元素；磷酸盐作为缓冲体系；葡萄糖作为碳水化合物无细菌生长繁殖提供能量；丙酮酸钠促进金黄色葡萄球菌的生长；高浓度的氯化钠起到选择性，不能耐受高盐环境的细菌在该培养基上生长受到抑制。北京陆桥技术股份有限公司 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培养18-24h。Baird-Parker平板361培养18-24h或45-48h。将Baird-Parker平板和血平板上的典型菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。GB 4789.10-2010 定性检测北京陆桥技术股份有限公司Baird-Parker培养基Baird-Parker培养基原理：原理：胰蛋白胨、牛肉浸粉和酵母膏粉提供碳氮源、B族维生素和生长因子；丙酮酸钠和甘氨酸能够促进葡萄球菌的生长；氯化锂和亚碲酸钾抑制非葡萄球菌的微生物；含有卵磷脂酶的葡萄球菌降解卵黄使菌落产生透明圈，而脂酶作用则产生不透明的沉淀环；凝固酶阳性的葡萄球菌还能还原亚碲酸钾而产生黑色菌落；琼脂作为培养基的凝固剂。北京陆桥技术股份有限公司使用注意事项：使用注意事项：1、亚碲酸钾卵黄增菌液应在培养基冷却至 50左右时加入；2、无菌的添加成分在加入前应先放置到室温，避免冷的液体 造成琼脂凝结或形成片状物；3、成分加入后培养基缓慢充分混匀，尽快分装。4、平板配置好后，48h之内使用完。5、接种前，平板表面适度干燥。1、亚碲酸钾卵黄增菌液应在培养基冷却至 50左右时加入；2、无菌的添加成分在加入前应先放置到室温，避免冷的液体 造成琼脂凝结或形成片状物；3、成分加入后培养基缓慢充分混匀，尽快分装。4、平板配置好后，48h之内使用完。5、接种前，平板表面适度干燥。北京陆桥技术股份有限公司GB 4789.10-2010 定性检测Baird-Parker平板：Baird-Parker平板：金黄色葡萄球菌圆形突起、光滑、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘淡色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。北京陆桥技术股份有限公司血琼脂平板原理:原理:蛋白胨、牛肉粉作为基础营养物质为细菌生长提供所需的氮源、碳源及其他的营养元素；氯化钠维持体系的渗透压；琼脂作为凝固剂；血液中含有丰富、且营养均衡的物质能促进营养苛求细菌的生长；此外某些细菌生长能产生溶血素，使培养基中的红细胞裂解，从而在菌落周围形成透明溶血圈。北京陆桥技术股份有限公司溶血分类溶血：菌落周围形成草绿色溶血环。溶血：菌落周围形成透明溶血环。溶血：菌落周围不形成溶血环。肺炎链球菌-溶血金黄色葡萄球菌-溶血表皮葡萄球菌-溶血北京陆桥技术股份有限公司 血平板：血平板：金黄色葡萄球菌呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。GB 4789.10-2010 定性检测北京陆桥技术股份有限公司取新鲜配置的兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入BHI培养物0.2mL-0.3mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以已知血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18-48h，重复前面的凝固酶试验。结果判定血浆凝固酶试验北京陆桥技术股份有限公司血浆凝固酶试验原理 大多数金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，该物质能使血浆中纤维蛋白原变成不溶性纤维蛋白，附于细菌表面生成凝块，因而具有抗吞噬的作用。凝固酶试验常用于判定该菌是否具有致病力。葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种，一种结合在细胞壁上，称为凝集因子，它直接作用与血浆中的纤维蛋白原，使之凝集成块发生沉淀，包围于细菌外面。另一种血浆凝固酶在菌体产生后，被释放与培养基中，称为游离凝固酶，它不直接作用于血浆纤维蛋白原，与血浆中的凝血素结合变成凝固酶样物质，该物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成固态纤维蛋白，从而使血浆呈凝固状态。北京陆桥技术股份有限公司 阳性对照 空白 溶解后的空白 阴性对照 阳性对照 空白 溶解后的空白 阴性对照北京陆桥技术股份有限公司冻干血浆操作注意事项冻干血浆操作注意事项1、先用0.5mL生理盐水溶解均匀。2、添加新鲜的可疑菌BHI培养物。3、添加阳性（金黄色葡萄球菌）阴性（表皮葡萄球菌）BHI新鲜培养物作为对照。4、培养后，每半小时观察结果。观察时轻拿轻放，不要 摇动。观察至6h，以第一次出现凝固为准。如出现疑 似，可重新试验。北京陆桥技术股份有限公司 GB 4789.10-2010 平板计数法北京陆桥技术股份有限公司样品处理：样品处理：25g样品+225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水，于无菌均质杯或均质袋中，均质混匀。十倍梯度稀释GB 4789.10-2010 平板计数法北京陆桥技术股份有限公司样品接种及计算：样品接种及计算：根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL和0.4mL接种量分别加入三块Baird-Parker平板，涂布均匀。361培养45-48h。将典型菌落进行确认实验，并计算结果。GB 4789.10-2010 平板计数法北京陆桥技术股份有限公司Baird-Parker涂布接种北京陆桥技术股份有限公司如果只有一个稀释度平板的菌落数在20cfu-200cfu之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。最低稀释度平板的菌落小于20cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落。某一倍稀释度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，但下一个稀释度平板上没有典型菌落，计数该级稀释度平板上的典型菌落。平板计数法计算说明北京陆桥技术股份有限公司某一倍稀释度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在20cfu-200cfu之间，计数该级稀释度平板上的典型菌落，按公式计算。平板计数法计算说明北京陆桥技术股份有限公司举例1举例1：公式一：T=AB/Cd T=654105=520稀释度稀释度10-110-2菌落数65（4/5）6平板计数法计算说明北京陆桥技术股份有限公司两个连续稀释度的平板菌落数均在20cfu-200cfu之间，按公式计算：平板计数法计算说明北京陆桥技术股份有限公司举例：公式二：公式二：T=(18335+35+2145)/1.10.145)/1.10.1 =(110+17)1010/1.1 =1200稀释度稀释度1010-1-11010-2-2菌落数183(3/5)21(4/5)平板计数法计算说明北京陆桥技术股份有限公司 GB 4789.10-2010 MPN法北京陆桥技术股份有限公司样品处理：样品处理：25g样品+225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水，于无菌均质杯或均质袋中，均质混匀。十倍梯度稀释GB 4789.10-2010 MPN法北京陆桥技术股份有限公司样品接种：样品接种：根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管。361培养45-48h。GB 4789.10-2010 MPN法北京陆桥技术股份有限公司菌落确认：菌落确认：用接种环从有细菌生长的各管中，移取一环分别接种Baird-Parker平板，361培养45-48h。Baird-Parker平板上出现典型菌落，做血浆凝固酶试验。GB 4789.10-2010 MPN法北京陆桥技术股份有限公司Thank You!