出芽短梗霉产色素能力弱化菌株的筛选.pdf

第 2 2卷第 1期 2 0 0 3年 1月 无 锡 轻 工 大 学 学 报 J o u r n a l o f W u x i Un i v e r s i t y o f Li g h t I n d u s t r y V0 1 2 2 No 1 J a n 2 0 0 3 文章 编号：1 0 0 90 3 8 X 2 0 0 3)0 1 0 0 1 6 0 5 出芽短梗霉产色素能力弱化菌株的筛选 朱一晖，张 丽敏，詹晓北(江 南大 学 iT _-业 生物技 术教 育部 重点实验 室，江 苏 无 锡 2 1 4 0 3 6)摘 要：出芽短梗霉在发酵过程 中会产生一种与黑 色素相似的黑色物质，并且这种物质会牢固地 粘附 在短梗 霉 多糖 上 对 出芽短梗 霉 Au 0 6 口 s l z m p u l l u l 口 B 一 1菌株进 行6 0 C o诱 变，获得 了一株 产 色素能 力缺 失型 菌株 C o 3。其 菌落和发 酵液颜 色 为 白色或 淡绿 色 红外光 谱 和磁核 共振 图谱 表 明 该 菌株 的产物 与标 准短梗 霉多糖 样 品有相 同的 结构 关键词：出芽短梗霉；短梗霉多糖；6 0 C o诱变；产色素能力弱化菌株 中图分类号：Q 8 1 5 文献标识码：A I s o l a t i o n o f A u r e o b a s i di u m p ul l u l a n s 6 0 Co M u t a g e n s i s S t r a i n s t h a t Pr o d u c e Pu l l u l a n wi t h Re d u c e d Pi g m e nt a t i o n ZHU Yi h u i。Z HANG I i-m i n，ZHAN Xi a o-b e i、(Ke y L a b o r a t o r y o f I n d u s t r i a l B i o t e c h n o l o g y，Mi n i s t r y o f E d u c a t i o n S o u t h e r n Y a n g t z e Un i v e r s i t y，Wu x i 2 1 4 0 3 6，C h i n a)Ab s t r a c t：Aur e o b a s i di um pul l u l an s r e l e a s e s a me l a ni n l i k e bl a c k p i gme nt d u r i n g t h e c u l t i v a t i o n a n d t h e pi g m e n t wa s t i gh t l y a d he r e d t O t h e p ul l u l a nThe f e a s i b i l i t y o f叫Co mut a g e ne s i s f o r p i g m e nt f r e e p u l l u l a n pr o du c t i o n wa s s t u di e d o n A“r 6 口 s “m p ul l u l an s B一 1 s t r a i n A p i g me n t f r e e mut a nt (Co 3)wa s o b t a i n e d T h e c o l o n y a n d b r o t h o f s t r a i n Co 3 a r e wh i t e o r l i g h t g r e e n A n a l y s i s o f i n f r a r e d s pe c t r a a nd C NM R s p e c t r u m c o n f i r me d t h a t t h e p r o d u c t wa s i d e n t i c a l wi t h t h e s t a n d a r d p u l l u l a n s a mp l e Ke y wo r d s：Aur e o b a s i di u m pu l l u l an s；p u l l u l a n；叫Co m u t a g e n e s i s；p i gme nt f r e e m u t a n t 多糖是一类高分子化合物，在食品，化学及 医 药工业有着广泛 的应用 传统的天然多糖和 化学合 成高分子化合物都有其局限性 微 生物多糖 生产周 期远低于植物 和海藻多糖，而且产量、产 品质量和 价格受季节和气候影响不大。并 且可 以安全地应用 于食品、医药、化妆品等行业。可 以被微 生物降解 近年来微生物多糖研究得到 了迅猛发展，其 中有些 已具备了工业应用价值并已工业化 短梗霉 多糖是 由出芽短梗 霉(Au r e o b a s i d i u m 收稿 日期：2 0 0 20 6 2 7；修回 日期：2 0 0 2 1 0 1 6 基金项 目：江苏 省国际 合作项 目资助课题(B S 9 9 7 1 9)作者简介：朱一晖(1 9 7 6一)，男，福建 漳州人，工学硕士，助教 p u l l u l a n s)合成 的微 生物多糖 它是一种天然的水 溶性中性 葡聚糖，无色，无味，无毒，具有 良好的耐 热性、耐盐性及耐酸碱性，可广泛应用于食 品、化妆 品、涂料、光敏树脂、肥料、铸造、烟草以及制药等工 业 1 I 在发酵过程中，出芽短梗霉会分泌出与黑色素 相似的黑色或墨绿色物质，这种物质会牢固地粘附 在短梗霉多糖上，很难用一 般方法除去，限制 了短 梗霉多糖 的应用 3 J 这 种黑色素可 以通过 S e v a g 维普资讯 http:/ 第 1期 朱一晖等：出芽短梗霉产色素能力弱化 菌株 的筛选 1 7 分馏法【4 J 去 除，但 是要完全去除黑色素，必须重复 多次 S e v a g分馏 法，而 每一 次 除色 素会 损失 大 约 1 5 的多糖，所以最终不含色素的短梗霉多糖得率 很低 此方法仅适 合于少 量多糖的提取，应用在大 量产品的提取上是不实际的 作者采用 0 C o诱变育 种方法，以期获得产色素能力缺失突变株 1 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 菌株A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s B 一 1，作 者 所在实验室提供 1 1 2 培 养基 1)种 子 培 养 基 组 分(g d L)：蔗 糖5，(NH 4)2 8 0 4 0 0 6，K 2 H P O4 0 5，Mg S 0 4 0 O 1，Na C 1 0 1，酵母浸膏 0 0 6 2)斜面与平板培养基组分(g d L)：马铃薯 2 0，蔗糖 2，琼脂 2 p H为 6 5 3)发酵培养基与种子培养基相同 1 2 实验方法 1 2 1 培养 方 法 1)发酵种子的培养：由斜面接一环种子至三角 瓶，2 5 0 mL摇瓶装液量 5 0 mL，2 8、2 0 0 r mi n培 养 3 6 h，即为摇瓶种子液 取 5 mI 摇瓶种子液，接 入装 液量 为 1 5 0 mL的 5 0 0 mL摇 瓶，2 8、2 0 0 r mi n 培养 2 4 h，即为发酵罐种子液 2)摇瓶培养：5 0 mL摇瓶装液量 5 0 mL，接种 量为 5，2 8、2 0 0 r mi n培养 1 2 0 h 3)发酵罐培养：1 5 L发酵罐(B i o s t a t C I O 一 3)的 装液量为 9 L 接种量为 5，发酵温度为 2 8，搅 拌转速为 4 0 0 r mi n，通气量为 1 L (I。mi n)，培养 1 4 4 h 1 2 2 6 o C o诱 变方 法 1)出发菌株菌悬液的制备：方法参见文献 2 2)诱变方法：将制备好的菌悬液各 5 mI。移至 5支试管中 按照照射剂量计算好照射距离，将 5支 试管分别放置于相应位置，照射时间为 3 0 mi n 5】3)培养：取 0 5 mI 处理后 的菌悬液进行稀释 分离，涂布于土豆琼脂平面上，2 8培养 5 d 1 2 3分 析 方法 1)菌体量的测定：见文献 2 2)短梗霉多糖的测定：见文献 2 3)致死率计算：致死率=逝 4)筛选方法：挑选白色、浅绿色，表面湿润的菌 落，转接到斜面 摇瓶培养，观察发酵液颜色 测定 多糖含量 1 2 4短梗 霉 多糖结 构鉴 定方 法 1)短梗霉多糖纯 化：发酵液在 7 0 0 0 r mi n离 心 3 0 mi n，倾出上清液 上清液 中加入两倍体积的 无水乙醇，4放 置 1 2 h 在 7 0 0 0 r mi n离心 2 0 rai n，倾去上清液，将沉淀的粗多糖用丙酮和乙醚反 复冲洗，再溶于蒸馏水 中 溶液置于截流相对分子 质量为 1 2 0 0 0 1 4 0 0 0的透析袋中，透析 3 d，中间 换 1 0次去离子水，得到的短梗霉多糖溶液用 S e v a g 试剂法去蛋白 去蛋 白后 的短梗霉多糖溶液再置于 截流相对分子质量为 1 2 0 0 0 1 4 0 0 0的透析袋 中，透析 3 d，中间换 1 0次去离子 水 透析后的溶液进 行冷冻干燥，得到 白色精制短梗霉多糖 2)红外光谱分析：采用石腊油研糊法 取 5 mg 左右样 品，置于 Na C 1 盐 片上，加入分析 用液体石 腊，分散后轻轻研磨，涂成薄层，上机分析 3)核磁共振 分析：干燥 固体 样品用溶剂 D 0 溶解，p D为 7，样品质量浓度 3 0 mg mL以上，温度 3 5，样品管外径为 5 mm，内标是二甲基硅戊烷磺 酸钠(D s s )，图谱宽度 2 0 0 2结果与讨论 2 1 菌株的6 o c o辐射诱变 2 1 1 致死率计算与诱变剂量的选择对培养好 的平板菌落进行计数，按照致死率公式计算照射致 死率，结果见图 1 1 OO 80 6 0 斟 4 o 2 O O 0 2 1 0 4 1 0 6 1 0 8 1 0 l OX 1 0 1 2X 1 0 诱变剂量，R 图 1 o c 0 诱变剂量与致死率关系 Fi g 1 Re l a t i o n o f 6 o Co d o s a g e a nd l e t ha l i t y 根 据 图 1的 结 果，确 定 6 o C D诱 变 剂 量 为 81 0 R 2 1 2 诱变结果按 1 2 2所述方法进行诱变，得 2 0余株菌落颜色为白色或淡绿色的诱变菌株 将所 得菌株 5 d转接一次平板，转接 3次后，得 5株性状 较为稳定的菌株进行复筛，复筛结果见表 1 维普资讯 http:/ 1 8 无锡轻工 大 学 学 报 第 2 2卷 表 1 6 e C o 诱变菌株 主要性状 Ta b 1 Fe r me nt a t i o n p r o pe r t i e s of mu t a nt a n d s t a r t s t r a i n 将 C o 3菌株进行连续 3次 传代实验，摇瓶发酵 结果见表 2 表 2 C o 3菌株传代实验结果 Ta b 2 Ge n e t i c s t ab i l i t y t e s t of s t r a i n Co 3 从表 2可以看 出，菌株 C o 3经 3次 传代后，产 量稳定在 1 5 g d L左右，菌落颜色为淡绿色 2 1 3 产 色素能 力缺 失 突变株 与原 菌株 产 色素情 况对比C o 3菌落形态与原菌株对比见图 2 图 2 C o 3突变菌株 菌落形态与原菌株对比 Fi g 2 Co mpa r is o n o f c o l on y of s t a rt s t r a i n an d mut a n t 将 C o 3菌株和原菌 株发酵液离心，去除菌体，将原菌株发酵液稀释 1 0倍，C o 3发酵液 不稀释，以 纯水为空 白，在 3 7 0 7 0 0 n m 的可见波长范围内进 行扫描，产色素能力缺失突变株与原菌株 的可见光 光谱吸收对比见图 3 由图 3可知，该菌株 仍产少量色 素，但与原菌 株相比，色素已大 幅度减少 虽然在现在的发酵条 件下该菌株多糖产量 比原菌株低，也 比国外文献报 道略低，但 由于色素的减少，大大 简化 了多糖纯化 步骤，有利于保持多糖的 生物活性，减少了提取过 程中的多糖损 失 对该 菌株 发酵 工艺条 件进行研 究，可以进一步挖掘该菌 的产糖能力 O 8 O 6 趔 0 o O 4 O2 O 3 5 O 4 00 4 50 5 00 55 0 6 00 6 50 7 0 0 扫描 波 J P n m 图 3 原 菌株 与产色素能 力缺 失菌株 发酵液 的可见 光 谱 图 Fi g 3 S p e c t r u m o f f e r me n t a t i o n b r o t h o f s t a r t s t r a i n a n d m u t an t 2 2 发酵罐实验 按 1 2 1所述实验方法进行 1 5 L发酵罐实验，发酵曲线见图 4 发酵 时间，h 一 蟮 据 图 4 1 5 L发酵 罐发 酵过程 曲线 Fi g 4 Gr o wt h c u r v e a nd f e rme nt a t i on c u r v e o f s t r a i n Co 3 i n 1 5 L f e r me nt o r 从发酵曲线可以看 出，蔗糖质量浓度在前 4 8 h 内迅速下降，在第 7 0小时左右基本消耗完全 在蔗 糖质量浓度迅速下 降的同时，发酵液 p H值也随之 下降，在第 3 0小时 p H下降至最低点 3，然后恒定在 这个值，直至发酵结束 菌体 生长延迟期很短，在第 6小时左右进入对数生长期 菌体量在前 4 8 h迅速 增加，从第 4 8小时开 始，菌体生长进入稳 定期，在 发酵结 束前，菌体量有少量减少 短梗霉多糖的产 生略滞后于菌体生长，发酵开始后 1 2 h内几乎没有 多糖产生，从第 1 2小时后开始有多糖合成，第 1 6小 时以后多糖合 成速度加 快，最终多糖产量 为 1 5 5 I 在整个发酵过程 中，只有少量的色素产生，最 终发酵 液的颜 色呈淡绿 色 与摇瓶实验相 同，最终 发酵液颜 色 比原始菌株 浅，可 以简化多糖提取过 程，提高多糖的提取得率，并且通过对发酵条件 的 研究，可进一步提高该菌株多糖的产量 维普资讯 http:/ 第 1期 朱一晖等：出芽短梗霉产色素能力弱化 菌株的 筛选 1 9 2 3 红外光谱分析 从红外光谱 图(图 5)中可 以看 出，样品的吸收 峰与标样的吸收峰完全一致 在 8 4 0 C I T I-1 处有一吸 PP M 1 01 7 6 1 01 2 9 9 9 5 9 8 0 31 7 9 9 3 7 5 4 3 7 3 7 3 收峰。这表明该样品以 a 一 键为主要连接键 2 4 核磁共振分析 核磁共振谱 见图 6 5 0 00 F r e q(H z)2 2 88 4 8 2 27 7 97 2 2 3 9 7 7 1 8 06 1 7 1 7 9 7 5 7 1 69 6 3 3 1 65 8 1 3 2 0 00 l 5 0 0 1 0 00 c m 。图 5 短梗霉多糖 红外光谱图 Fi g 5 I nf r a r e d s p e c t r u m o f c o mme r c i a l pu l l ul a n a nd p ul l u l an pr o duc e d by S t r a i n Co 3 I n t e n s i t y 9 4 31 8 8 9 3 6 2 9 5 7 0 01 73 1 9 1 6 63 1 1 5 81 2 F X 一9 0 Q NM R#P PM 8 7 3 6 0 9 7 2 6 2 1 O 7 1 9 4 l 1 6 9 0 1 1 2 6 3 2 4 1 3 6 2 9 8 1 4 2 O 0 1 F r e q(Hz)1 6 5 5 2 6 1 6 3 3 3 0 1 61 8 0 2 1 5 5 2 1 1 1 4 2 2 2 2 1 41 6 4 9 4 4 9 9 5 S PECTR0M ETER l n t e n s l t y 1 6 7 21 98 9 6 8 4 61 5 9 0 9 9 0 6 5 1 0 41 5 95 9 7 3 0 0 l O O 8 0 图 6 短梗霉多糖核磁共振谱图谱 Fi g 6 NM R s pe c t r u m o f pu l l u l an pr od u c e d by s t ra i n Co 3 在异头碳区域有 3个峰，分别对应于 a 一 1，4连 接(1 0 1 7 6，1 0 1 2 9)和 a 一 1，6连 接(9 9 5 9)化学位 移为 8 0 3 1和 7 9 9 3的峰对应 a 一 1，4连接 的 C4，化 学位移 为 6 3 2 4和 6 2 9 8的峰 对应 a 一 1，4连接 的 C 一 6，化学位移为 6 9 0 1的峰则对应于 a 一 1，6连接的 C-6 其它化学位移在 7 0 8 0之 间的峰对应于糖链 上其它位置的碳 由于在异头碳区域无其它的响应 峰，这说明在该多糖 样品中无其它的键型存在 短 梗霉多糖典型分子结构见图 7 O CH OH CH OH O OH OH 图 7 短梗霉 多糖典型分子结构 Fi g 7 St u c t u r e o f pul l u l a n O#1 2 3 4 5 6 7 、，、维普资讯 http:/ 2 0 无锡轻工大 学 学报 第 2 2卷 3 结 论 通过。C o 诱变，筛选得到一株产色素能力缺失 菌，摇 瓶和 1 5 L发酵罐 发酵 实 验 多糖 产量 为 1 5 参考文献：g L 左右，发酵 液颜 色 为淡 绿 色 该 菌 株 简化 了 多糖 纯化步骤，有利于保持多糖的生物活性和提取过程 中多糖的损失 对该菌株的多糖产物进行红外和核 磁共振光谱分析，其结构与短梗霉多糖标样一致 1 S Yu e n P u l l u l a n a n d i t s a p p l i c a t i o n s J P r o c e s s B i o c h e mi s t r y。1 9 7 4，(1 1)：7 9 2 T h o ma s J P o l l o c k。L i n d a Th o r n e。R i c h a r d W A r me n t r o u t I s o l a t i o n o f n e w Au r e o b a s i d i u m s t r a i n s t h a t p r o d u c e h ig h mo l e c u l a r we i g h t p u l l u l a n wi t h r e d u c e d p i g me n t a t i o n J A p p l i e d a n d E n v i r o n me n t a l Mi c r o b i o l o g y。1 9 9 2。(3)：8 7 7 8 8 3 3 F Y o u s s e f。T R o u k a s。C G B i l i a d e r i s P u l l u l a n p r o d u c t i o n b y a n o n p ig me n t e d s t r a i n o f Au r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s u s in g b a t c h a n d f e d b a t c h c u l t u r e J P r o c e s s B i o c h e mi s t r y，1 9 9 9。3 4：3 5 5 3 6 6 4 张惟杰 糖 复合物生化研究技术 M 杭 州：浙江大学出版社。1 9 9 4 【5 詹晓北。郑志永。贾薇。等，大肠杆菌6 0 C o 诱变育种及其发酵生产聚唾液酸条件【J 无锡轻工大学学报。2 0 0 0，1 9(4)：2 1 25 6 G o r i n QA J，C a r b o n 一 1 3 n u c l e a r ma g n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r o s c o p y o f p o l y s a c c h a r i d e s J A d v C a r b o h y d r C h e m B i o c h e m，1 9 8 1。38：1 3 1 0 4，7 B ri a n J C a t l e y。A l i s o n R a m s a y。C a t h e ri n e S e r v i s Ob s e r v a t i o n s o n t h e s t r u c t u r e o f t h e f u n g al e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e。p u l l u l a n J C a r b o h y d r a t e R e s e a r c h。1 9 8 6。1 5 3：7 9 8 6 (责任编辑：李春丽)(上接第 6页)2 Gil J V。Ma t e o J J，J i me n e z M。e t a 1 A r o m a c o m p o u d s i n w i n e a s i n fl u e n c e d b y a p i c u l a t e y eas t s J J F o o d S e i，1 9 9 6。6 1(6)：1 2 471 24 9。1 26 6 3S c h e r i e r P。D r a w e n F。S e h mi d M，C h a n g e s i n t h e c o mp o s i t i o n o f n e u t r a l v o l a t i l e c o mp o n e n t s d u ri n g t h e p r o d u c t i o n o f a p p l e b r a n d y J J S c i F d A g r i c。1 9 7 8。2 9(8)：7 2 8 7 3 6 4N o b l e A C I n A n al y s i s o f F o o d s a n d B e v e r a g es，H e a d s p a c e T e c h n i q u e s M N e w Y o r k：A c a d e mi c P r e s s，1 9 7 8 2 0 3 2 0 8 5 S t a s h e n k o H，Ma c k u C。S h i b a m a t o TMo n i t o ri n g v o l a t i l e c h e mi c a l s f o r me d f r o m mu s t d u r i n g y e a s t f e rm e n t a t i o n J J A g r i c F o o d Ch e m，1 9 9 2，4 0(1 1)：2 2 5 72 2 5 9 6 S o l es K M，Ou g h C S，K u n k e e R E E s t e r c o n c e n t r a t i o n d i f f e r e n c e s i n wi n e s f e rm e n t ed b y v a r i o u s s p e c i es a n d s t r a in s o f y e a s t s J A m JE n o l V i t i c，1 9 8 2，3 3(1)：9 4 9 8 【7 Ma n g a s J J。G o n z a l e z M P，R odr i g u e z R。e t a 1 Sol i d p h a s e e x t r a c t i o n a n d d e t e rm i n a t i o n o f t r a c e a r o m a a n d fl a v o u r c o m p o n e n t s i n c id e r b y G C-MS J C h r o m a t o g r a p h i a。1 9 9 6。4 2(1 2)：1 0 1 1 0 5 8 He n r y kH J，Kr y s t i an W，E r wi nW，e t a 1 Sol i d p h a s e f o r t h e a n al y s i s o f some alc o h o l s a n d est e r s i n b e e r：c o rn p a ri son w i t h s t a t i c h e a d s p a c e me t h od J J A g r i c F o o d C h e m。1 9 9 8。4 6(4)：1 4 6 9 1 4 7 3 9A l e x a n d r a S，J a n u s z P A n al y s i s o f fl a v o r v o l a t i l es u s i n g h e a d s p a c e sol i d p h a s e mi c r o e x t r a t i o n J J A g r i c F o o d C h e m，1 9 9 6。4 4 (8)：2 1 8 72 1 9 3 1 0 E l i z a b e t h V，S u s an E E Mo n i t o ri n g est e r f o r ma t i o n i n g r a p e j u i c e f e r me n t a t i o n s usi n g s o l i d p h ase mi c r o e x t r a t i o n c o u p l e d wi t h g a s c h r o ma t o g r a p h y-ma s s s p e c t rome t r y J J A g r i c F o o d C h e m，2 0 0 1，4 9(2)：5 8 9 5 9 5 1 1 徐岩 一种苹果酒酵母和用该酵 母发酵酿制苹果酒的方法 P 中国专利：1 3 3 5 3 9 2 A，2 0 0 2 0 2 1 3 1 2 Wi fl i a m s A A F l a v o u r r e s e a r c h a n d t h e c i d e r i n d u s t r y J J I n s t B r e w，1 9 7 4。8 0(5)：4 5 5 4 7 0 (责任编辑：李春丽)维普资讯 http:/