响应面法优化灯盏花乙素的提取工艺_郑小力.pdf

（），（），（），（），（），（），结果是羟苯丁酯与相邻峰不能完全分开，更换色谱柱亦是如此，不进样梯度洗脱此峰仍然存在，固在此洗脱程序上微调，分别考察了在、时间内流动相甲醇（）乙酸铵（），（），（），结果在 内完成梯度变化时羟苯丁酯与其分离效果最佳，其余各目标峰的分离度也符合要求，因此最终选择“.”项下梯度洗脱条件。.提取溶剂的选择 预实验时分别选用甲醇、甲醇水溶液、乙醇对川贝清肺糖浆进行提取，发现选用甲醇提取效果优于乙醇，而 甲醇水溶液和甲醇提取效果无显著差别，固选取 甲醇为提取溶剂。.样品检测的结果讨论通过本文建立的方法测得 个厂家防腐剂的用量均符合要求。羟苯酯类又称尼泊金类，本次实验发现有一厂家的说明书中标明含有苯甲酸、尼泊金，未具体说明是尼泊金类中的哪一防腐剂，通过本文所建立的方法检测出为羟苯乙酯；还有另一厂家说明书辅料项下列出了其他辅料但未标明有添加防腐剂，同样通过此方法检测出其中含有苯甲酸和羟苯乙酯，建议应当加强对企业标签说明书的管理。.结论 本方法准确、高效，适用于川贝清肺糖浆中苯甲酸、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯的含量测定，可作为川贝清肺糖浆质量控制的分析方法，用于同时考察不同厂家川贝清肺糖浆中各种防腐剂的添加情况，为药品的安全监管提供有力可靠的支撑。参考文献龚雪媛，赵静芳，沈子博，等.基于 技术检测川贝清肺糖浆中掺伪山麦冬的研究.海峡药学，（）：.卫生部药品标准中药成方制剂.第二册，.陈建琴.川贝清肺糖浆中苦杏仁苷、甘草苷和甘草酸的双波长 法测定.中国医药工业杂志，（）：.谢莹莹，粟贵，赵勇，等.法测定川贝清肺糖浆种蔗糖的含量研究.海峡药学，（）：.国家药典委员会编.中国药典（年版四部）.北京：中国医药科技出版社，：.尕藏卓玛，杨丽琼，达娃卓玛.测定小儿清热止咳口服液中苯甲酸的含量.中国民族民间医药，（）：.蔡锦雄，庞赛，梁爱仙，等.高效液相色谱法测定复方氨酚美沙糖浆中抑菌剂含量.药品评价，（）：.张艳，杨颖.高效液相色谱法测定诺氟沙星滴眼液中羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯含量.中国药业，（）：.国家药典委员会编.中国药典（年版四部）.北京：中国医药科技出版社，：.响应面法优化灯盏花乙素的提取工艺郑小力（宁德市食品药品检验检测中心，福建宁德）摘要：目的 采用响应面法优化灯盏花乙素的提取工艺。方法 基于单因素试验结果，采用回流提取方法，以甲醇浓度、提取时间、料液比为自变量，设计灯盏花乙素提取工艺的响应面试验，确定最佳提取条件。结果 最终确定灯盏花乙素的最佳提取工艺是：甲醇浓度，加热回流提取时间.，料液比，灯盏花乙素提取率理论值与实际验证值分别为.、.，相对误差为.。结论 模型理论值与实验值接近，表明通过响应面法建立的模型可行性较好，建立的灯盏花乙素最佳提取工艺稳定可行。关键词：灯盏花；灯盏花乙素；提取；单因素试验；响应面试验中图分类号：文献标识码：文章编号：（）（，）：.，.：，.海峡药学 年 第 卷 第 期 .，.，.：；灯盏花为菊科植物短葶飞蓬（.）.）的干燥全草，亦名灯盏细辛。其提取物灯盏花素的主要成分为灯盏花乙素，又可名为野黄芩苷，是灯盏花的主要药用成分，该化合物在扩张脑血管，抗血液凝固，防治艾滋病、降低型糖尿病早期肾脏病变等疾病上有可观的疗效。灯盏花乙素属于黄酮类化合物，联合灯盏花乙素注射液可从多个发病环节治疗急性脑梗死，能减轻神经功能损害，在传统中医理论指导下，灯盏花素作为改进型中药制剂治疗缺血性寒证型脑梗塞疗效明显；研究发现与对照组相比，经灯盏花乙素处理后的原代神经元氧糖剥夺模型中神经元轴突较完整，能有效 抑 制 脑 缺 血 后 的 神 经 元 的 凋亡，；细胞缺血缺氧后使用灯盏花乙素可以显著降低细胞内 的含量，抑制 超载，灯盏花乙素能抑制 激活，抑制 活化，活化，减少 产生，减少细胞炎症性死亡，同时发现灯盏花乙素能通过调节糖代谢和脂质代谢防治糖尿病微血管病变、非酒精性脂肪肝；另外灯盏花乙素能通过抑制间质纤维化改善 大鼠的心功能，在常规西药的基础上联用灯盏花素注射液治疗均可显著提高治疗急性脑梗死患者的有效率；信号通路是动脉粥样硬化的重要调节因子，激活 信号通路及其下游的蛋白表达可保护内皮细胞免受氧化应激损害，发挥抗氧化应激作用。灯盏花乙素起效快，生物利用度高，且毒副作用小，临床上用于治疗脑供血不足、脑血栓、冠心病、心绞痛等疾病。目前，灯盏花制剂一定程度上能够改善神经功能缺损和急性脑梗死，但制剂不同，其优势不同，与疗程长短、结局指标差异等有关；灯盏花乙素有抗炎作用以及抗多种心脑血管疾病，其机制与氧化应激反应有关，但是否对其他氧化应激相关性疾病也有防治作用，尚有待进一步研究。本研究先采用单因素试验，再采用响应面法对灯盏花乙素提取工艺进行优化，确定最佳的提取工艺路线。本研究所建立的提取工艺稳定可行，可为灯盏花乙素的进一步开发应用提供参考。图 灯盏花乙素 仪器与材料.主要仪器 旋转蒸发仪（公司）；低温冷却液循环泵、循环水式多用真空泵（杭州庚雨仪器有限公司）；高效液相色谱仪（公司，配置 检测器）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；纯水超纯水一体机（公司）。.药物与试剂 灯盏细辛，产地云南，由福建中医药大学黄鸣清教授鉴定为菊科植物短葶飞蓬（.）.）；灯盏花乙素（批号：，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，.，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；甲醇、磷酸、二氯甲烷（均为分析纯，西陇科学股份有限公司）。试验方法.灯盏花乙素含量检测方法 参考 年版中国药典一部中灯盏细辛（灯盏花）项下含量测定项对灯盏花乙素进行含量测定。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的 柱（，.，），以甲醇.磷酸溶液（）为流动相，紫外检测器检测波长为 。进样量 ，流速 ，理论板数按灯盏花乙素峰计算应不低于。.样品溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取灯盏花乙素对照品.，置于 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得.的灯盏花乙素对照品溶液，记录色谱图（见图）。供试品溶液的制备：取本品粗粉约 ，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入甲醇（参照中国药典灯盏细辛篇进行提取）适量，称定重量，加热回流提取 ，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，记录色谱图（见图）。.灯盏花乙素含量的测定精密称取精密称取灯盏花粗粉 置锥形瓶，根据单因素试验和响应面试验所需的不同的提取条件进行提取，取出放冷，补足重量，摇匀，滤过取 续滤液过滤膜后按.项下检测方法，使用高效液相色谱仪进行含量测定，然后根据下式计算灯盏花乙素提取率。.图 灯盏花乙素 色谱图.灯盏花乙素标准品；.灯盏花提取液 灯盏花乙素提取率（）标 样 标 式中：标为灯盏花乙素标准品浓度（）；标为灯盏花乙素标准品峰面积；样为灯盏花粗粉提取液中灯盏花乙素峰面积；为灯盏花粗粉提取液体积（）；为灯盏花粗粉（）。.提取方法的选择本研究采用超声辅助提取法与加热回流提取法相比较，优选最佳提取方式。超声提取法：称取灯盏花粗粉约 ，精密称定，加至锥形瓶中，加入 的甲醇溶液，进行超声处理提取 ，取 续滤液过膜后，使用.的方法用高效液相色谱仪进行含量检测。加热回流提取法：称取灯盏花粗粉约 ，精密称定，置于圆底烧瓶中，同样加入 的甲醇溶液，在恒温水浴锅加热回流提取 ，取 续滤液过膜后，使用.的方法用高效液相色谱仪进行含量检测。根据实验数据的计算结果来看，加热回流提取的灯盏花乙素含量为.，超声处理的灯盏花乙素含量为.，因此加热回流提取方法更加适合用于灯盏花乙素的提取，所以后续单因素实验将使用加热回流提取方法来进行考察。.单因素试实验.考察甲醇浓度对灯盏花乙素提取率的影响：主要通过控制甲醇浓度这一变量，固定其他变量，根据实验来检测其含量，确定最优的甲醇浓度。称取 份灯盏花粗粉各约 ，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，在 个烧瓶中分别精密加入不同浓度（、）的甲醇溶液各 ，在水浴锅中加热水浴回流提取 ，按.项下样品溶液的制备处理收集的续滤液，取 续滤液过滤膜后按.项下检测方法，使用高效液相色谱仪进行含量测定。.考察回流提取时间对灯盏花乙素提取率的影响：主要通过控制回流提取时间这一变量，固定其他变量，根据实验来检测其含量，确定最优的加热回流提取时间。称取 份灯盏花粗粉各约 ，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，进行编号，在 个烧瓶中分别精密加入浓度为 的甲醇溶液 ，在水浴锅中加热回流提取，时间间隔设为 ，从 开始，结束，按.项下样品溶液的制备处理收集的续滤液，取 续滤液过滤膜后按.项下检测方法，使用高效液相色谱仪进行含量测定。.考察料液比对灯盏花乙素提取率的影响：主要通过控制料液比这一变量，固定其他变量，根据实验来检测其含量，确定最优的料液比。称取 份灯盏花粗粉各约 ，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，按照不同料液比（、）分别在 个烧瓶中精密加入不同体积（、）浓度为 的甲醇溶液，在水浴锅中加热回流提取.，按.项下样品溶液的制备处理收集的续滤液，取 续滤液过滤膜后按.项下检测方法，使用高效液相色谱仪进行含量测定。.考察回流提取次数对灯盏花乙素提取率的影响：主要通过控制回流提取的次数这一变量，固定其他变量，通过实验来检测其含量，确定最优的回流提取次数。精密称取 份灯盏花粗粉 ，置于圆底烧瓶中，在烧瓶中加入体积为 ，浓度为 的甲醇溶液，在水浴锅中进行第一次加热回流提取，时间设为.，取续滤液，并按上述方法再提取 次，按.项下样品溶液的制备处理收集的续滤液，取 续滤液过滤膜后按.项下检测方法，使用高效液相色谱仪进行含量测定。.响应面试验设计 单因素试验优化方法，不能给出直观的图形，因此也不能凭直觉观察其最优化点，想要直观的体现出最佳工艺，找到最佳区域，就需要开展响应面试验。响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应作为一个或多个因素的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件。通过大量的实验数据，在单因素试验的基础上，以灯盏花乙素提取率为响应值，利用 试验设计原理，设计 因素 水平的因素水平表（见表）。表 试验因素和水平表因素水平甲醇浓度（）（）料液比（）回流提取时间（）（）.海峡药学 年 第 卷 第 期 结果与分析.单因素实试验结果与分析.考察甲醇浓度对灯盏花乙素提取率的影响：由图 可见，在其他条件一定时，灯盏花乙素的提取率随着甲醇浓度的降低而升高，甲醇浓度为 时提取率达到最大之后开始呈下降趋势，考虑到实验成本与操作等多方面因素，因此可以确定甲醇浓度 为最佳浓度。图 甲醇浓度对灯盏花素提取率的影响.考察回流提取时间对灯盏花乙素提取率的影响：由图 可见，在其他条件一定时，灯盏花乙素提取率随回流提取时间的增加呈现先升高趋势，回流提取时间为.提取率的最高，之后稍有下降趋势，可能是由于加热时间过长，灯盏花乙素可能有破坏和损失，含量反而下降。因此可以确定其最优的回流提取时间为.。图 回流提取时间对灯盏花乙素提取率的影响.考察料液比对灯盏花乙素提取率的影响：由图 可见，在其他条件一定时，灯盏花乙素的提取率随着甲醇溶液体积的增加而增加，含量的最高点是在料液比 的时候之后提取率趋于平缓，这可能是由于灯盏花乙素已基本溶出，再增加溶剂用量只会增加成本，灯盏花乙素提取率基本不会再增加，因此可以确定最优的料液比为。.考察回流提取次数对灯盏花乙素提取率的影响：由图 可见，在其他条件一定时，回流提取第一次时，提取液中的灯盏花乙素含量最大，所提取含量约占总提取量的，当回流提取第二次时提取量迅速减少，仅为第一次的，第三次提取液中灯盏花乙素的含量极少。根据含量测定的结果，再考虑到提取成本，故选择最适提取次数为 次。图 料液比对灯盏花乙素提取率的影响图 回流提取次数对灯盏花乙素提取率的影响.响应面试验结果与分析根据 中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果，选取甲醇浓度、提取时间和液料比 个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法中心组合试验方案，因子编码水平及试验结果如表 所示。表 响应面试验结果试验号实测提取率（）预测提取率（）.模型的建立：利用 .软件对表 试验数据进行多元回归拟合，得到灯盏花乙素提取率对甲醇浓 .度（）、料液比（）、回流提取时间（）的二次多项回归模型为：灯盏花乙素提取率.对所得模型进行显著性检验，结果如表 所示，回归方程系数及显著性检验见表。表 灯盏花乙素提取的显著性检验方差来源平方和自由度均方 值 值回归模型.残差.失拟.纯误差.总和.表 回归方程系数及显著性检验模型中的系数项系数估计值自由度标准误差置信度区间低端值置信度区间高端值 值 值常数项.由表、表 可以看出模型的回归决定系数（.），表明.的响应值符合此模型，各个因数与响应值之间存在着较好的线性关系，校正决定系数 .，说明有.的试验数据的变化可用此模型来解释，拟合程度良好。回归模型的一次项 不显著，、显著，二次项均显著，交互项、均不显著，说明不同的提取分离工艺对灯盏花乙素提取率的影响并不是简单的线性规律那么简单。另外从 值可以看出单因素对灯盏花乙素提取的影响顺序为：，即为甲醇浓度 料液比 回流提取时间。.响应面分析：为确定甲醇浓度、回流提取时间、料液比 个因素及其交互作用对灯盏花乙素提取率的影响，根据回归方程绘出响应面及等高线图。响应面坡度陡峭程度与等高线形状能反应出交互效应强弱趋势，如若响应面坡度较为平缓，表明其可以忍受处理条件的变异，而不影响响应值大小，反过来说，如若坡度比较陡峭，说明响应值处于处理条件改变非常敏感。如果等高线的形状为椭圆则说明两个交互因素作用显著，而形状为圆形，说明不显著。其中各两个因素的交互作用响应面图和等高线图见图 。.甲醇浓度与料液比的交互分析：图 是以回流提取时间位于中心水平（.）时，甲醇浓度和料液比对灯盏花中灯盏花乙素含量交互作用的响应面图，由图可知灯盏花素提取率先随甲醇浓度的升高呈先升高趋势，当甲醇浓度到达后灯盏花乙素提取率随浓度升高而降低；灯盏花乙素提取率随料液比的升高呈现缓慢升高后趋于平缓的趋势，拐点出现在料液比为 的时候。图 甲醇浓度与料液比交互作用对灯盏花素提取率的影响.甲醇浓度与回流提取时间的交互分析：图 是以料液比位于中心水平（）时，甲醇浓度和回流提取是时间对灯盏花中灯盏花乙素含量交互作用的响应面图，由图可知灯盏花乙素提取率随甲醇浓度和回流提取时间的升高呈现先升海峡药学 年 第 卷 第 期高再降低的趋势，当甲醇浓度大于 时提取率不升反降，回流提取时间少于.前的提取率升高较快，一旦时间超过.提取率表现出降低的趋势，可能是由于加热提取时间延长对灯盏花乙素造成破坏的缘故。图 甲醇浓度与回流提取时间交互作用对灯盏花素提取率的影响.料液比与回流提取时间的交互分析：图 是以甲醇浓度位于中心水平（）时，回流提取时间和料液比对灯盏花中灯盏花乙素含量交互作用的响应面图，由图可知灯盏花乙素提取率随料液比的升高呈先缓慢升高后趋于平缓，拐点出现在料液比为 时；而灯盏花乙素提取率随回流提取时间的增加呈现出先升高后降低的趋势，开始随回流提取时间增长提取率升高，当时间大于.后，时间越长提取率越低，可能是由于灯盏花乙素属于黄酮类成分，提取时间太长不稳定容易损失。图 料液比与回流提取时间交互作用对灯盏花素提取率的影响.最佳工艺的确定与验证试验 通过 .软件分析，得到灯盏花乙素工艺参数最佳组合是：甲醇浓度.，料液比.，回流提取时.，提取率为.，为了检验该最佳提取工艺的可靠性，进行验证实验。综合考虑，将所得到的最佳工艺条件进行调整为：甲醇浓度，料液比，回流提取时间.。在该实验条件下进行 组平行试验，进行验证经过计算得到灯盏花乙素提取率为.，因为灯盏花乙素提取率理论值和验证值较为接近相对误差为.，可以认为通过响应面试验法来优化灯盏花乙素提取工艺是有效可行的。讨论通过比较各试验项下灯盏花乙素含量，发现回流提取效果优于超声提取，故确定用回流提取方法进行单因素和响应面试验。为了建立灯盏花乙素最佳提取工艺，以灯盏花为原料，考察了甲醇浓度、提取时间、料液比等因素对提取灯盏花乙素的影响。采用单因素试验分析了各因素对灯盏花乙素提取率的影响，在单因素的相关实验中，确定了甲醇浓度、料液比 和加热回流提取时间.为灯盏花乙素提取纯化工艺的最佳条件。后续通过响应面试验，利用 .软件设计，对试验条件进行分析，设置自变量：甲醇浓度、料液比、加热回流提取时间 因素与因变量灯盏花乙素提取率的数学模型进行了回归分析，试验结果得到的模型显著性较好，说明该模型较为准确可靠，能较有效估测出在不同试验条件下灯盏花乙素的提取率。最终确定提取灯盏花乙素的试验优化工艺是：甲醇浓度，料液比，加热回流提取时间.。同时也通过三次平行验证试验来判断该响应面试验结果，结果表明灯盏花乙素实际验证值为.，与回归模型预测的提取率理论值为.基本一致，说明该响应面模型可行性较好，得到的优化工艺参数具有准确性和可靠性，对灯盏花乙素的提取工艺可提供一定的参考依据和指 .导意义。参考文献曾心怡，陈树和，石振拓，等.灯盏花素提取工艺影响因素研究.湖北中医杂志，（）：.葛月宾，尚莹莹，黄琳，等.灯盏花素提取纯化工艺及其片剂的制备.中南民族大学学报（自然科学版），（）：.王国栋，张立庆，李振兴，等.灯盏花素提取技术及其质量控制研究进展.特产研究，（）：.楼云雁，石森林，葛卫红，等.正交试验法优选灯盏花素的提取工艺.浙江中医杂志，（）：.胡倩，戴霖霖，王玲，等.灯盏花素的提取与分离工艺优化研究.化学与生物工程，（）：.田帅华，李钦.灯盏细辛中野黄芩苷提取纯化工艺研究.中成药，（）：.李莉，周卫涛，李峰.正交试验法优选黄芩茎叶中野黄芩苷提取工艺研究.世界最新医学信息文摘，（）：.李雨芹，宋春江.奥扎格雷钠联合灯盏花素注射液治疗急性脑梗死的 分析.中医药导报，（）：.朱新星，申圣春.辨证用灯盏花素治疗急性脑梗死 例临床观察.中医药导报，：.董丽，孙士波，孙曙光.灯盏花乙素抗氧化应激机制在防治心脑血管疾病中的研究进展.昆明医科大学学报，（）：.朱君荣，李云曼，方伟蓉.灯盏乙素对 细胞拟缺血性损伤的保护作用研究.中国药房，（）：.刘畅.灯盏花乙素对脑缺血神经元的保护作用及机制研究.昆明：昆明医科大学硕士学位论文，.葛文秀，罗云，谢学恒，等.灯盏花乙素药理作用机制研究进展.中国实验方剂学杂志，（）：.孟令成，张瑜.灯盏花素对不稳定型心绞痛患者血清 及 的影响.中医药导报，：.李梦娇，原阳，孙文社，等.基于代谢组学的灯盏花素抗阿霉素心脏毒性作用机制研究.中草药，（）：.赵君，张允岭，支英杰，等.灯盏花素注射剂治疗急性脑梗死有效性和安全性的随机对照试验系统评价和 分析.中医杂志，（）：.，.，（）：.朱邦胜，孙洪胜，蔡明.黄芩茎叶中野黄芩苷的提取工艺研究.中医药临床杂志，（）：.，.（）（）（）.，（）：.陈莉，屠康，王海，等.采用响应曲面法对采后红富士苹果热处理条件的优化.农业工程学报，（）：.徐媛，王鲁峰，徐晓云，等.响应曲面法优化红葡萄柚番茄红素的提取工艺.食品科学，（）：.程水明，曾霞，周国钰，等.响应面法优化红肉火龙果果皮中花青素提取工艺.广东石油化工学院学报，（）：.克立硼罗软膏体外释放特性研究梁 逸，赵雅兰，马雪儿，韩冰晶，盛 平，张 梁，张春凤（中国药科大学中药学院，南京）摘要：目的 建立克立硼罗含量测定方法及软膏体外释放方法，为克立硼罗软膏一致性评价提供参考依据。方法 采用 法测定克立硼罗含量，以改良 扩散池法研究软膏体外释放特性，以优选的接收介质、人工膜、上药量和转速等条件对市售及自研克立硼罗软膏进行体外释放特性比较。结果 接收介质选择 .磷酸盐丙三醇（），人工膜选择.混合纤维素膜，上药量选择 ，转速选择 ，建立体外释放方法，计算得市售与自研软膏释放速率分别为（.）和（.）（），两者释药行为符合 模型。结论 含量测定方法专属性强，精密度良好，适用于克立硼罗含量测定，市售与自研克立硼罗软膏的释放速率接近，体外释放特性可视为等效。关键词：克立硼罗软膏；体外释放；高效液相色谱法；扩散池法中图分类号：.文献标识码：文章编号：（）作者简介：梁 逸，女（）。学历：在读硕士研究生。主要从事制剂研究。通讯作者：张春凤，女（）。职称：教授，博士生导师。研究方向：中药新药创制研究。，（，）：海峡药学 年 第 卷 第 期