五倍子酸对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺线粒体功能的影响_苏晴.pdf
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1、 499 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.45 No.6 2022 解剖学杂志 2022 年第 45 卷第 6 期五倍子酸对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺线粒体功能的影响*苏 晴 杨书平 李明欣 刘 莉 柴玉荣(郑州大学基础医学院组织学与胚胎学系,郑州 450001)摘要 目的:目的:研究五倍子酸对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺线粒体功能的影响。方法:方法:将昆明小鼠分为对照组、D-半乳糖致衰老模型组、五倍子酸组。H-E染色观察各组小鼠胸腺组织的结构变化;-半乳糖苷酶染色方法检测胸腺中的衰老细胞;线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位变化;免疫印迹检测线粒体融合蛋白(Mfn1
2、 和Mfn2)以及动力相关蛋白1(Drp1)的表达水平;免疫组织化学方法检测Mfn2的原位表达。结果:结果:五倍子酸能恢复胸腺正常的组织结构;与对照组比较,D-半乳糖组胸腺中的衰老细胞明显增多,线粒体膜电位明显下降,Mfn1和Mfn2表达水平无明显变化,Drp1表达水平降低;而五倍子酸组中,衰老细胞数目减少,线粒体膜电位上升,Mfn1和Mfn2表达水平无明显变化,Drp1表达水平升高,差异均有统计学意义。结论:结论:五倍子酸对D-半乳糖致衰老小鼠的胸腺线粒体有一定保护功能,可能是通过维持线粒体融合、分裂的平衡,增加线粒体膜电位以维持线粒体正常功能。关键词 胸腺;五倍子酸;D-半乳糖;衰老;线粒
3、体;小鼠Effect of gallic acid on thymic mitochondrial function in D-galactose treated mice*Su Qing,Yang Shuping,Li Mingxin,Liu Li,Chai Yurong(Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)Abstract Objective:To investigate the effects
4、of gallic acid(GA)on thymic mitochondrial function in D-galactose(D-gal)induced aging mice.Methods:Kunming mice were divided into a control group,a D-gal aging mouse model group,and a GA treatment group.The changes of thymic structure in each group were observed by H-E staining.Senescent cells in th
5、ymic tissues were detected by SA-Gal staining.Mitochondrial membrane potential was detected by mitochondrial membrane potential detection kit(JC-1 method).The expression levels of mitochondrial fusion proteins(Mfn1 and Mfn2)and dynamic related protein 1(Drp1)were tested by Western blotting.The situ
6、expression of Mfn2 was further examined by immunohistochemistry.Results:After GA administration,the normal histology structure of thymus can be restored.Compared with the control group,the senescent cells in the thymus of D-gal group were significantly increased,mitochondrial membrane potential was
7、significantly decreased,the expression levels of Mfn1 and Mfn2 were not significantly changed,and the expression level of Drp1 was decreased.In the GA group,the number of senescent cells decreased,the mitochondrial membrane potential increased,the expression levels of Mfn1 and Mfn2 did not change si
8、gnificantly,and the expression level of Drp1 increased.Conclusion:Gallic acid has a protective effect on thymic mitochondria function of D-galactose induced aging mice,which may be by maintaining the balance between mitochondrial fusion and division and increasing mitochondrial membrane potential to
9、 keep the normal function of mitochondria.Key words thymus;gallic acid;D-galactose;aging;mitochondria;mousedoi:10.3969/j.issn.1001-1633.2022.06.002论 著*河南省高等学校重点科研项目(21A310022)第 1 作者 E-mail: 通信作者,E-mail: 收稿日期:2021-07-30;修回日期:2022-03-08胸腺是T淋巴细胞发育和产生免疫耐受的主要淋巴器官1。胸腺衰老与免疫衰老密切相关,与伴随的许多慢性疾病的发展有关,例如动脉粥样硬化、高
10、血压和2型糖尿病等2。研究表明,胸腺衰老和功能失调可能是严重的COVID-19疾病的一个诱发因素3。线粒体是高度动态的细胞器,可根据细胞代谢需求维持融合和分裂的平衡,即“线粒体动力学”,从而维持其正常的形态、分布和功能。线粒体的形态适应对衰老、细胞周期、凋亡等至关重要4-6。在衰老和与年龄相关的疾病中可见异常 500 的线粒体结构,表明线粒体动力学随着细胞的衰老而受到损害7。五倍子酸(3,4,5-三羟基苯甲酸,gallic acid,GA)也称为没食子酸,是一种天然多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等多种作用,对D-半乳糖诱导胸腺加速衰老具有一定的保护作用8。五倍子酸是否通过影响线粒体功
11、能,改善衰老胸腺的组织结构,尚未清楚。本研究旨在从线粒体膜电位和线粒体动力学角度探索五倍子酸对胸腺线粒体功能的影响及机制。1 材料和方法1.1 动物分组和主要试剂1.1 动物分组和主要试剂30只2月龄昆明小鼠购自郑州大学实验动物中心,体质量为29 37 g,清洁级环境饲养。动物实验通过郑州大学动物实验伦理委员会的批准。30只昆明小鼠随机分为对照组、D-半乳糖致衰老模型组(D-半乳糖组)、五倍子酸治疗组(五倍子酸组),每组5只,雌雄各半。对照组腹腔注射0.9%生理盐水,第3 8周同时灌胃给予五倍子酸的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na);D-半乳糖组腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖9,3 8
12、周同时灌胃给予CMC-Na;五倍子酸组腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖,38周同时灌胃给予250 mg/kg 五倍子酸8。每天定时给药,8周后处死动物,取材备用。主要试剂如下:Mfn1和Mfn2抗体(上海艾博抗有限公司);动力相关蛋白1(Drp1)抗体(武汉三鹰);RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂(上海碧云天);凝胶试剂盒(北京鼎国);五倍子酸、线粒体膜电位检测试剂盒(北京索莱宝);免疫组织化学二抗显色试剂盒(北京中杉金桥)。1.2 H-E染色和免疫组织化学显色1.2 H-E染色和免疫组织化学显色胸腺组织一叶,4%多聚甲醛固定24 h,流水冲洗,石蜡包埋,制作石蜡切片,片厚5 m。采
13、用H-E染色,中性树胶封片后,光学显微镜观察、拍照。胸腺组织切片经过梯度乙醇脱蜡复水后,微波修复法进行抗原修复,PBS冲洗,滴加相应血清封闭,加一抗:兔抗Mfn2多克隆抗体(150),置4孵育过夜,滴加生物素标记的山羊抗兔IgG于37恒温箱中孵育30 min,DAB显色,苏木精复染细胞核,冲洗返蓝,盐酸乙醇分色,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片,光学显微镜拍照、观察阳性细胞的定位和表达。1.3 衰老相关的1.3 衰老相关的-半乳糖苷酶(senescence-associated-半乳糖苷酶(senescence-associated -galactosidas,SA-galactosidas,S
14、A-Gal)检测-Gal)检测一叶胸腺组织,固定后,冰冻切片,厚度7 m。显 色 液:1 mg/mL的X-Gal,-20 保 存 备用。母液:40 mmol/L的柠檬酸/磷酸钠盐缓冲液(pH6.0),5 mmol/L亚铁氰化钾冲液,5 mmol/L铁氰化钾冲液,150 mmol/L氯化钠,2 mmol/L氯化镁,4避光保存。组织切片冷丙酮固定20 min,PBS冲洗,避光滴加显色液,阴性对照组滴加不含x-gal的母液,37孵育3 5 h,PBS 冲洗,中性红复染细胞核,封片,显微镜观察、拍照。1.4 线粒体膜电位检测1.4 线粒体膜电位检测胸腺组织研磨,400目网筛分离胸腺细胞。线粒体膜电位检
15、测试剂盒(JC-1)按照说明书步骤进行,配置JC-1染色工作液,设置阳性对照,胸腺细胞重悬于细胞培养液,加入0.5 mL JC-1染色工作液,37孵育20 min,4离心5 min,弃上清,JC-1染色缓冲液(1)重悬后,荧光酶标仪检测。JC-1聚集在线粒体基质中,形成聚合物,产生红色荧光;当线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,产生绿色荧光。红绿荧光的相对比例可以衡量线粒体去极化状态,JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变,用于检测细胞膜电位的变化。1.5 免疫印迹检测1.5 免疫印迹检测胸腺组织中加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂后进行研磨提取蛋白质,4离心,取上清液,B
16、CA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量,上样缓冲液,100水浴锅加热5 min使蛋白质变性。SDS-PAGE蛋白电泳,并将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原,分别孵育一抗Mfn1(11 000)、Mfn2(15 000)、Drp1(13 000)、-actin(12 000),4过夜,TBST洗膜。加辣根过氧化物酶标记的二抗(15 000),室温孵育2 h,加ECL显色剂曝光成像。1.6 图像分析和统计学处理1.6 图像分析和统计学处理在高倍显微镜下观察免疫组织化学和SA-Gal染色的切片,每张切片随机选取5个不同视野采集图像,观察阳性颗粒在细胞中的分布,统计抗体阳性的细胞面积和
17、SA-Gal染色的阳性区域。图像分析使用Image J软件,并用GraphPad Prism 8软件进行数据统计分析和作图。计量资料以xs表示,组间比较使用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 小鼠胸腺组织结构分析2.1 小鼠胸腺组织结构分析H-E染色结果显示,D-半乳糖处理8周后,胸 501 腺组织的皮、髓质结构较紊乱,皮质区变薄,皮、髓质比降低;而对照组和五倍子酸添加6周后的胸腺组织皮、髓质交界较为明显,且周围皮质较厚。说明五倍子酸能明显改善D-半乳糖诱导的急性衰老引起的胸腺组织结构紊乱(图1,见封二)。2.2 五倍子酸减少了胸腺组织中的衰老细胞2.2 五倍子酸减少
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