载药蛋白质_聚苯硼酸复合纳米微球制备及其释药性能研究_殷雪旸.pdf
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1、研究论文 Article *E-mail:;Tel.:021-31249907 Received November 16,2022;published December 13,2022.Supporting information for this article is available free of charge via the Internet at http:/sioc-.Project supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21935002).项目受国家自然科学基金(No.21935002)
2、资助.116 http:/sioc- 2023 Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences Acta Chim.Sinica 2023,81,116123 化 学 学 报 化 学 学 报 ACTA CHIMICA SINICA 载药蛋白质/聚苯硼酸复合纳米微球制备及其释药性能研究 殷雪旸 顾恺 邵正中*(聚合物分子工程国家重点实验室 复旦大学高分子科学系 先进材料实验室 上海 200433)摘要摘要 蛋白质纳米颗粒具有良好的生物相容性和生物降解性,易于进行额外的表面修饰,用作药物输送系统提高了生物利用度
3、,减少了药物分子的毒副作用.本工作在利用苯硼酸基团与再生桑蚕丝蛋白(RSF)上相关侧基之间具有路易斯酸-碱配对反应的基础上,通过 3-丙烯酰胺苯硼酸(APBA)在 RSF 水溶液中原位聚合,使 RSF 分子链重排形成微球并在表面负载抗炎中药,制备了载药丝蛋白/聚苯硼酸纳米微球.此尺寸分布均匀的微球直径约为 550600 nm,表面光滑且在水中的分散性能良好;对乔松素、杜鹃素和地奥司明三种药物的负载率分别为 7.8%,11.9%和 13.4%,包封率分别为 75.0%,89.1%和 93.7%.载药微球控制释放约 7 d,且缓释行为具有 pH 响应性.丝蛋白/聚苯硼酸纳米微球与主体药物协同作用提
4、高了自由基清除速度和清除效率,优于直接给药组.与此同时,将 RSF 改换为牛血清白蛋白或明胶蛋白,采用此方法也能制成尺寸分别为 260 和 100 nm 的白蛋白/聚苯硼酸微球或明胶蛋白/聚苯硼酸微球.由此,三种不同尺寸、电性和药物释放速率的蛋白质/聚苯硼酸纳米微球有望适应多种静脉注射和皮下或腹腔注射药物传输的需求.关键词关键词 蛋白质;苯硼酸;抗炎药;纳米载体;控制释放 Preparation of the Protein/Polyphenylboronic Acid Nanospheres for Preparation of the Protein/Polyphenylboronic A
5、cid Nanospheres for Drug Loading and Unloading Drug Loading and Unloading Yin,Xueyang Gu,Kai Shao,Zhengzhong*(State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers,Department of Macromolecular Science,Laboratory of Advanced Materials,Fudan University,Shanghai 200433)Abstract Protein nanoparticle
6、s(NPs),biocompatible and biodegradable,can be easily surface modified.In particular,am-phiphilic proteins act as“surfactants”that help form microparticles while undergoing molecular chain rearrangement.These NPs have been successfully used as drug delivery systems,improving bioavailability and reduc
7、ing the toxic effects of drug molecules.The use of regenerated silk protein(RSF)with m-acrylamidophenylboronic acid(APBA)composites as drug car-riers for loading anti-inflammatory herbal extracts was reported.Firstly,a simple and rapid method was used to prepare silk protein/polyphenylboronic acid n
8、anospheres,in brief,RSF solution and a certain amount of initiator were added to APBA solution,and the pH was adjusted by NaOH,and the polymerization was initiated by heating at 90 under nitrogen protec-tion with stirring at 500 r/min.After 2 h of reaction,a milky solution was obtained,which formed
9、silk protein/benzeneboronic acid nanospheres with hydrophobic interior and hydrophilic surface.The drug-loaded silk protein/polyphenylboronic acid nanospheres with an average size of 550 to 600 nm were prepared by mixing with the drug solution after dialysis and stirring at room temperature for 12 h
10、 to load the drug by adsorption.By the same method,drug-loaded albumin/polyphenylboronic acid microspheres and collagen/polyphenylboronic acid microspheres with sizes around 260 nm and 100 nm,respectively,could be prepared.The results observed by scanning and projection electron microscopy and dynam
11、ic light scattering showed that the drug-loaded silk protein/polyphenylboronic acid nanomicrospheres displayed regular spherical shape indicating smoothness and good dispersion with no obvious aggregation.The highest drug loading rate was about 13.4%,and the en-capsulation rate was over 90%.Also,suc
12、h drug-loaded nanospheres could achieve controlled release for about seven days and their slow release behavior was pH-responsive,with faster drug release in buffer solution at pH5.5 than in buffer solution at pH7.4.In addition,the synergistic interaction of the silk protein/polyphenylboronic acid n
13、anomicrospheres with the sub-ject drug improved its free radical scavenging rate and scavenging efficiency,which was superior to that of the direct drug delivery group.Thus,three protein/polyphenylboronic acid nanomicrospheres with different sizes,electrical properties and drug release rates may be
14、adaptable to a wide range of intravenous and subcutaneous or intraperitoneal drug delivery needs and have great potential for clinical applications.Keywords proteins;phenylboronic acid;anti-inflammatory drugs;nanocarriers;controlled release DOI:10.6023/A22110464 化化 学学 学学 报报 研究论文 Acta Chim.Sinica 202
15、3,81,116123 2023 Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences http:/sioc- 117 1 引言 炎症相关的疾病被认为是对人类健康的最大威胁之一,根据世界卫生组织(WHO)报告的数据显示,全球每五个患病者中就有三个人因这类疾病导致死亡1.抗炎症药物水溶性差,化学性质不稳定,对正常细胞的毒性大,最终会产生耐药性2-3.各种治疗方法,如可离子化药物的盐化、与环糊精的络合等4-7大多未能增强药物的治疗效果,存在突释或休眠性释放、组织特异性、排泄等抗炎药物传输系统性能不理想的问题.因此,选
16、择性地将治疗药物靶向实体致病区域是实现疾病缓解和最终治愈的主要方法,如何提高治疗药物在致病区域的浓度并延长药物作用时间则是研究的重要方向8-13.基于蛋白质的纳米结构尺寸更小且表面积更大,促使它们能与其他分子很好地发生相互作用.蛋白质纳米颗粒(NPs)具有良好的生物相容性和生物降解性,并易于进行表面修饰.特别是由具有两亲性的蛋白质作为“表面活性剂”,在进行分子链重排的同时,帮助形成微颗粒.这些 NPs 已被成功地用作药物输送系统,提高了生物利用度,减少了药物分子的毒副作用14.再生桑蚕丝蛋白(RSF)是一种天然的“两亲性嵌段共聚物”,它具有良好的生物相容性、透气透氧性以及优异的生物可降解性、结
17、构可控性和环境稳定性.由于其低细胞毒性和几无免疫原性15-17,因此近年来,RSF常被用作载体材料,负载药物小分子或大分子以及无机纳米粒子18-21.另一方面,常被称为第五组分的牛血清白蛋白(BSA)22-24和明胶蛋白(GEL)25-26同样具备了生物相容性、生物降解性、非免疫原性、长半衰期、有淋巴保护作用以及环境可持续性、低成本高效益等优势,可以作为药物传输系统的主要成分.纳米药物传输载体的尺寸大小决定了细胞摄取和体内生物分布.通常粒径在 200600 nm 之间,尺寸均一的纳米微球可以作为理想负载药物的载体.对于静脉给药要求的纳米医学颗粒的尺寸较小27,而通过皮下或腹腔注射治疗则需要较大
18、的颗粒来延长其在注射部位的滞留时间28.然而,目前的研究对于蛋白质纳米载体的药物负载量、突释以及在实际应用中的纳米粒子尺寸等问题关注较少.乔松素、杜鹃素都是传统的中药中间体,乔松素具有抗菌、抗原虫、抗氧化、抗凋亡等作用,药理学研究表明,其对感染性休克、癌症、心血管病等疾病有治疗作用.杜鹃素具有抗炎、抗氧化、抗菌活性、细胞保护以及免疫抑制的作用.杜鹃素已被证明对乳腺炎、过敏性哮喘和 TNBS 诱导的结肠炎症具有显著的治疗效 果29.地奥司明是一种传统的中药,Fattori 等30发现黄酮类化合物地奥司明能够减少脂多糖引起的炎症性疼痛和腹膜炎.在本工作中,我们改进了以再生桑蚕丝蛋白基为主的蛋白质纳
19、米载体,用简单快捷的方法制得了适合负载含羟基抗炎中药的蛋白质基纳米微球,解决了其在实际应用中的若干问题,并研究了载药微球的缓释行为和自由基清除效率.2 结果与讨论 2.1 负载抗炎中药的蛋白质纳米微球的制备 根据本课题组18的前期工作,首先使用乙醇诱导和冷冻结合的方法制备载药 RSF 纳米微球.RSF 分子链在含有药物的不良溶剂中迅速发生构象转变,即由无规或螺旋结构向-折叠转变以形成微晶,冷冻过程中的剪切力进一步促使构象转变,并使微晶聚集从而形成微球,实现药物负载.尽管通过计算表明所形成的 RSF 微球对乔松素、杜鹃素的负载量分别为 2.5%和 4.1%,包封率分别为32.6%和49.4%(地
20、奥司明不溶于乙醇而无法以此原位制备载药微球),但是观察发现,该方法制备RSF 纳米微球(20%乙醇条件下)在载药后存在尺寸分布较宽(粒径在 50500 nm 不等)、表面粗糙且形状不规整等问题,并且载药 RSF 微球易产生大面积聚集(图 S1,见支持信息).另外,由于纯 RSF 微球骨架较为脆弱,在40 kHz 超声 5 min 条件下微球崩碎,此类载药体系具有一定的局限性.因苯硼酸(PBA)中的相关基团可以与 RSF 中的碱性基团,如氨基和胍基等,发生路易斯酸-碱配对反应31,本研究尝试苯硼酸衍生物在 RSF 水溶液中原位聚合的方式,以聚苯硼酸诱导 RSF 微球的形成并改善其分散性、稳定性和
21、特异性等.根据 RSF 的一级结构17,RSF的分子链被认为是由亲水段和疏水段交替构成的“两亲性多嵌段共聚物”32,因此,在 RSF 水溶液中聚合 3-丙烯酰胺基苯硼酸(APBA),得到的疏水聚苯硼酸衍生物(PAPBA)有可能与 RSF 的疏水段发生相互作用,以形成微球的疏水内核,而RSF的亲水链段朝向纳米粒子外部,包裹住内部疏水链段,形成内部疏水表面亲水且分散稳定的 RSF-PAPBA 微球.在同样实验条件下若不利用苯硼酸衍生物参与反应,纯丝蛋白微球无法形成(图S2,见支持信息).RSF 与 APBA 的混合溶液在高温下引发聚合反应,2 h 后,溶液呈乳白色(图 S3,见支持信息),且放置
22、48 h并无沉淀现象.图 1 表明,此乳白色液体实际为微球的悬浊液,其间微球的平均粒径大约 500 nm,分布较为均匀且表面光滑;即便负载上乔松素(Pin)、杜鹃素(Far)和地奥司明(Dio)后,微球的尺寸基本没有变化,也无明显的聚集.根据傅立叶变换红外光谱(FTIR)测试结果(图S4,见支持信息),微球中同时有 RSF 和 PAPBA 存在,表明我们成功地合成了 RSF-PAPBA 纳米微球.为避免由 RSF 在等电点(pH3.84.0)附近的无序聚集所导致的非规整或粘连的 RSF-PAPBA 纳米微球出现,我们在反应过程及后处理过程中均将环境的 pH 值固定在5.05.5左右.实际上,我
23、们发现当环境pH值降低而稍偏离于此时,微球的确不易形成或出现一定程度 化化 学学 学学 报报 研究论文 118 http:/sioc- 2023 Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences Acta Chim.Sinica 2023,81,116123 图图 1 RSF/聚苯硼酸纳米微球的扫描电镜(a)和透射电镜(b)图像以及分别负载乔松素(c,d)、杜鹃素(e,f)和地奥司明(g,h)的 RSF/聚苯硼酸纳米微球的扫描电镜和透射电镜图像 Figure 1 SEM and TEM images of R
24、SF-PAPBA(a,b),PinRSF-PAPBA(c,d),FarRSF-PAPBA(e,f),and DioRSF-PAPBA(g,h)nanospheres的聚集.猜想是RSF的-折叠晶区作为纳米级物理凝胶点,与疏水的 PAPBA 共同成为微球的核心区域,而此时RSF非晶区的松散结构将嵌入RSF纳米微球中,并且非晶区的亲水性氨基酸残基片段易向水中伸展,有利于各类药物的负载和逐级释放.乔松素、杜鹃素和地奥司明的紫外吸收波长分别为289,297 和 345 nm.通过相应的测试和计算,得到所制备的 RSF-PAPBA 纳米微球对乔松素、杜鹃素和地奥司明三种药物的负载量分别为7.8%,11.
25、9%和13.4%,包封率分别为 75.0%,89.1%和 93.7%,远高于前述乙醇冷冻法所得纯RSF纳米微球的载药能力,有潜力成为优异的纳米药物传输体系.这是因为苯硼酸基团可以作为电子受体,与电子供体原子(如氮和氧等)进行路易斯酸碱配对,例如 PBA 基团和药物中的胺基之间的氮硼(N-B)配位33,有助于开发具有高药物负载的药物输送系统34.乔松素、杜鹃素和地奥司明三种药物的结构具有相似性,即有多个羟基,因此药物分子易失去电子与 PAPBA 链上的缺电子硼原子发生配位作用,被负载到纳米微球上,其中地奥司明负载量最高,这一结果也与它的分子结构(图 S5,见支持信息)一致.根据报道,粒径在 20
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