亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳...谢和渗透调节相关指标的影响_邢逸夫.pdf

DOI:10.12131/20220176文章编号：2095 0780（2023）02 0070 08亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中免疫、解毒代谢和渗透调节相关指标的影响邢逸夫1,2，段亚飞2，韦政坤1,2，朱轩仪2，黄建华2，张家松21.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 1160232.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300摘要：鳃是对虾重要的呼吸器官，是亚硝酸盐毒性效应的主要靶器官，也是微塑料主要富集的部位之一。鳃组织参与了对虾渗透调节、氮排泄、免疫功能等生理过程，对对虾维持机体健康具有重要意义。为研究亚硝酸盐和微塑料单因素及复合胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃组织生理功能的影响，将对虾分为对照组、20 mgL1亚硝酸盐胁迫组(NIT)、10 gL1微塑料胁迫组(MP)、20 mgL1亚硝酸盐和10 gL1微塑料复合胁迫组(NM)，于第14天测定对虾鳃中相关指标变化。结果显示：1)氧化应激指标丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)浓度及抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性在胁迫后发生不同程度的改变；2)解毒代谢指标细胞色素P450基因(CYP450)和谷胱甘肽S-转移酶基因(GST)相对表达水平在胁迫后发生不同程度的紊乱；3)渗透调节指标如离子转运酶液泡型ATP酶(VATP)、Na+/H+交换体7(NHE7)、Na+/K+-ATP酶亚基(NKA-)、Na+/K+-ATP酶亚基(NKA-)、碳酸酐酶(CA)和水通道蛋白TIP4-1(TIP4)、钙通道蛋白1(CCP)、氯通道蛋白2(CLC)、水通道蛋白(AQP)基因的相对表达水平在胁迫后发生不同程度的紊乱；4)细胞凋亡因子基因(CASP-3)相对表达水平在3个胁迫组均显著降低(P0.05)。由此推断，亚硝酸盐和微塑料胁迫会诱导凡纳滨对虾鳃中免疫、解毒代谢和渗透调节相关指标变化，进而影响其正常的生理功能。关键词：凡纳滨对虾；鳃；亚硝酸盐；微塑料；解毒代谢；渗透调节中图分类号：S 917.4文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effects of nitrite and microplastic stress on immune,detoxificationmetabolism and osmoregulation-related indicators in gills ofLitopenaeus vannameiXING Yifu1,2,DUAN Yafei2,WEI Zhengkun1,2,ZHU Xuanyi2,HUANG Jianhua2,ZHANG Jiasong21.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China2.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of South China Sea FisheryResources Exploitation&Utilization,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Guangzhou 510300,ChinaAbstract:Gill is an important respiratory organ of prawns,the main target organ of nitrite toxicity effect,and also one of the第 19 卷第 2 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.22023 年 4 月South China Fisheries ScienceApr.，2023收稿日期：2022-06-22；修回日期：2022-08-10基金项目：国家自然科学基金项目(31902343)；广东省基础与应用基础研究基金(2021A1515012084)；广州市科技计划项目(202102080246)；广州市科学技术协会青年人才托举工程项目(X20210201039)；农业科研杰出人才培养计划(13210308)；中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2021SD19,2022RC01)；中国水产科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2021XT0604)；国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项(2019YFD0900500)作者简介：邢逸夫(1998)，男，硕士研究生，研究方向为水产动物环境生理。E-mail:通信作者：张家松(1971)，男，研究员，博士，研究方向为设施渔业养殖技术。E-mail:main enrichment sites of microplastics.The gill tissue participates in the physiological processes of prawns such as osmoregula-tion,nitrogen excretion,immune function,etc.,which is important for maintaining the prawns health.In order to investigatethe effects of single and combined stress of nitrite and microplastics on the physiological functions of gill tissues of Litopenaeusvannamei,we designed the control group,20 mgL1 nitrite stress group(NIT),10 gL1 microplastic stress group(MP),20mgL1 nitrite and 10 gL1 microplastic composite stress group(NM),and then measured the changes of immune and osmoticregulation in gills of shrimps on the 14th day.The results show that:1)The oxidative stress indicators such as the contents ofmalondialdehyde(MDA)and hydrogen peroxide(H2O2),and the activities of superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT)andglutathione peroxidase(GPx)changed at different degrees after the stress.2)The detoxification metabolic indicators such as therelative expression levels of cytochrome P450(CYP450),glutathione S-transferase(GST)and apoptosis factor(CASP-3)weredisturbed at different degrees after the stress.3)The relative gene expression levels of the osmoregulation indexes such as iontransporters(VATP,NHE7,NKA-,NKA-and CA)and channel proteins(TIP4,CCP,CLC and AQP)occurred at different de-grees of disorder after the stress.4)The apoptosis index sucha as the relative expression level of apoptosis factor(CASP-3)genedecreased significantly in the three groups(P0.05).Thus,it is inferred that nitrite and microplastic stress can induce thechanges of immunity,detoxification metabolism and osmotic regulation in the gills of L.vannamei,affecting its normalphysiological functions.Keywords:Litopenaeus vannamei;Gill;Nitrite;Microplastics;Detoxification metabolism;Osmotic regulation凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是世界范围内重要的水产养殖经济虾类之一。目前我国凡纳滨对虾养殖多采用集约化高密度养殖模式，养殖密度过高常导致环境胁迫进而诱发病害，影响对虾养殖效益1。亚硝酸盐是对虾养殖系统中重要的环境因子之一，养殖过程中残饵粪便的积累以及水循环不良等，会造成养殖水体中亚硝酸盐浓度升高，甚至高达 20 mgL12。研究表明，亚硝酸盐胁迫会导致水产动物免疫力下降，病原菌易感性增加，并影响动物生长和存活3-4。对虾养殖除了受环境因子影响外，还会受到外源污染物的影响。随着海洋环境污染问题的加剧，微塑料等环境污染物对水产养殖动物的影响同样不容忽视。研究发现，微塑料在对虾养殖环境及组织器官中均有检出5-6。微塑料除自身毒性外，因其具有粒径小、比表面积大等特征，容易吸附环境中的重金属、石油烃等其他环境污染物，继而对水生动物造成二次损伤7。鳃是对虾重要的呼吸器官，同时兼具渗透调节和氮排泄等功能，还参与清除病原体的免疫反应8。由于对虾鳃直接暴露于水环境中，极易受到环境胁迫的影响发生生理紊乱或损伤；病原还会通过鳃吸收进入虾类血淋巴中。此外，环境胁迫会影响对虾体内渗透压调节，而 Na+/K+-ATP 酶、水通道蛋白等在对虾机体渗透调节中发挥重要作用9-10。研究表明，亚硝酸盐胁迫会破坏虾类血蓝蛋白的正常携氧能力，进而导致机体缺氧，影响机体免疫11。微塑料在甲壳动物的鳃等组织中富集，会造成动物摄氧、摄食、代谢、免疫功能下降2,12，诱导对虾肠道菌群以及机体代谢紊乱13。目前尚未见关于亚硝酸盐和微塑料复合胁迫对凡纳滨对虾鳃免疫和渗透调节功能影响的研究报道。因此，本研究通过测定亚硝酸盐和微塑料单因素及复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中氧化应激、解毒代谢、细胞凋亡以及渗透调节相关指标的影响，旨在探讨亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织生理功能的影响，以期为凡纳滨对虾健康养殖提供理论参考。1 材料与方法 1.1 材料实验用凡纳滨对虾取自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，平均体质量为(6.30.2)g。实验前于 200 L 玻璃纤维桶中暂养7 d，每桶 30 尾。养殖水温(300.5)、盐度 30、pH 7.88.0，24 h 连续曝气。每天换水 50%，并按对虾体质量 5%投喂对虾配合饲料(广东越群生物科技股份有限公司)。实验用微塑料为聚苯乙烯塑料微球，粒径 5 m，购于青岛阿贝特有限公司。正式实验时使用去离子水将聚苯乙烯塑料微球配制成母液，按所需浓度进行添加。1.2 亚硝酸盐和微塑料胁迫实验将暂养 7 d 的健康对虾随机分为 4 组：对照组(CK)、亚硝酸盐胁迫组(NIT)、微塑料胁迫组(MP)、微塑料和亚硝酸盐复合胁迫组(NM)。每第 2 期邢逸夫等:亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中免疫、解毒代谢和渗透调节相关指标的影响71NO2组 3 个平行，每个平行 30 尾虾。根据环境中微塑料含量以及参考的文献资料，选用粒径 5 m 质量浓度 10 gL1为微塑料胁迫的实验浓度14。CK 组为正常养殖海水，与暂养期间的水质条件一致。NIT胁迫组的水体亚硝酸盐质量浓度设定为 20 mgL1，使用亚硝酸钠(无结晶水)进行调节。MP 组的水体微塑料质量浓度设定为 10 gL1，使用聚苯乙烯塑料微球母液进行调节。NM 组的水体亚硝酸盐质量浓度设定为 20 mgL1，微塑料质量浓度设定为 10gL1，亚硝酸盐和微塑料质量浓度调节方法如上所述。每 24 h 用分光光度计法检测水体亚硝酸盐氮(-N)、氨氮(NH3-N)质量浓度，并进行亚硝酸盐浓度相应调整。每 2 日全量换水，并补充相应浓度的亚硝酸钠或聚苯乙烯塑料微球，以维持胁迫条件的稳定。每次喂料 1 h 后，及时清除桶内残饵粪便。实验于胁迫第 14 天进行采样。每个平行组分别取 8 尾对虾，用灭菌后的解剖剪取鳃组织混合用于生化指标测定，样本取样后立即于80 保存；另取 5 尾对虾鳃组织混合用于基因表达分析，样本置于 RNA 保存液(RNAFollow，新赛美生物科技有限公司)中 4 保存 24 h，然后于80 保存。1.3 生化指标测定将冷冻保存的鳃组织样品冰上解冻后，使用预冷 PBS 漂洗去除组织液，滤纸拭干后称质量。使用组织匀浆机低温研磨，按照 m(组织):V(PBS)=1:9 制备组织匀浆，4、3 000 rmin1离心 10 min，取上清液于80 保存，用于生化指标测定。总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)和总蛋白均采用南京建成生物研究所同一批次生产的试剂盒进行测定，具体操作按照相应的说明书进行。1.4 基因表达分析使用 Trizol 试剂提取各组对虾鳃组织 RNA，使用 DNase I 去除其中的基因组 DNA，然后分别使用核酸定量仪和质量分数 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的质量和浓度。使用 ServicebioRTFirst Strand cDNA Synthesis Kit 将 RNA 反转录为 cDNA，保存于20 备用。根据 NCBI 数据库中的凡纳滨对虾细胞凋亡因子 Caspase-3(CASP-3)、细胞色素 P450(CYP450)、谷胱甘肽 S-转移酶(GST)、液泡型 ATP 酶(VATP)、Na+/K+转运 ATP 酶亚基 (NKA-)、Na+/K+转运ATP 酶亚基 (NKA-)、碳酸酐酶(CA)、Na+/H+交换器 7(NHE7)、氯通道蛋白 2(CLC)、水通道蛋白(AQP)、水通道蛋白 TIP4-1(TIP4)、钙通道蛋白 1(CCP)基因的 cDNA 序列，以-actin 为内参基因，使用 Primer premier 5.0 软件分别设计正反特异性引物(表 1)。表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study基因名称Gene name正向引物(53)Forward primer(53)反向引物(53)Reverse primer(53)CASP-3ATTATAGAGTGCCTGCGTTGCTACCTGCGATATCATGCCTAGATGCTTGGCYP450CGCCGCCAAGGAAGTGAAGGTGGGAGGCGATGGTGGTGTCGSTACGAACACTACGAACAGAAGGATGCGCCAGGAAGTCGATGTAGGTTAGCVATPGCCAAGTATGAGCACCTAGCAGACTCGTCCACCACCTTACTGAAGAGAGTIP4GTCTCTCTGAACCCTTGCCAAACTCGTTGCCTATGATTACCTGCGTCCTCCCPCCCTGAGACCTCTGTTTGCTGTGTGGCAGTGTTCTTCGCATGTTCCNHE7CACCGCCATCCTCACCAAGTTCACAGAAGAGCACAGCCACAATACCCLCGCCGATAGGAGGTGTGTTGTTCAGCGAAGAAGCCACGCCAGTAGTTCNKA-TGAAATCGTGTTTGCCCGTACCTCACCATCACCAGTTACAGCCACAATGNKA-GAACCCAGCCGACGAAGAATACGCAGCAACAATAGGTGGCAGGTAGCAQPGCAGCCATCTTGAAGGGAGTGACACGAGGACGAAGGTGATGAGGAGCACCTATTCTGGCTCCCTCACTACCCGTTCATCCTCTGGGCAACACTCG-actinAGCTCATTGTAGAAGGTGTGATGCCTCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG72南 方 水 产 科 学第 19 卷利用实时定量 qPCR 对各组上述几种基因的表达量进行检测，每个样品 3 个重复，相关操作使用 SYBR 荧光定量 PCR 试剂盒(AG)进行。qP-CR 反应体系为 15 L，包括 7.5 L SYBR Green ProTaq HS Premix(2)，0.6 L 10 molL1正向引物，0.6 L 10 molL1反向引物，1.0 L cDNA，5.3 L无 RNase 水。qPCR 反应程序为：95 30 s；95 5 s，60 30 s，40 个循环。各组每个基因的相对表达量以 CK 组为基准采用 2CT法计算。1.5 数据处理XSD所有数据均以“平均值标准差()”表示，并使用 SPSS 26.0 软件对各组数据进行单因素方差分析，采用最小显著差数法(LSD 法)检验组内及组间的显著性差异，P0.05 表示差异显著。2 结果 2.1 鳃组织氧化损伤指标分析与 CK 组相比，MDA 质量摩尔浓度在 MP 和NM 组均显著升高(P0.05，图 1-a)。H2O2质量摩尔浓度在MP 和 NM 组显著升高(P0.05)；MP 组的 H2O2浓度显著高于NM 组(P0.05，图 1-b)。2.2 鳃组织抗氧化酶活性分析与 CK 组相比，SOD 活性在 3 个胁迫组均显著升高(P0.05，图 2-a)。CAT 活性在NM 组显著升高(P0.05，图 2-b)。GPx 活性在 NIT和 MP 组显著升高(P0.05，图 2-c)。2.3 鳃组织解毒代谢与细胞凋亡相关基因表达分析与 CK 组相比，CYP450 基因的相对表达水平在 NIT 和 MP 组显著升高(P0.05)。GST 和 CASP-3 基因相aabb012345678aacb丙二醛质量摩尔浓度MDA molarity/(nmolmg1)50403020100过氧化氢质量摩尔浓度H2O2 molarity/(nmolmg1)(a)(b)CK NIT MP NMCK NIT MP NMCK.对照组；NIT.亚硝酸盐组；MP.微塑料组；NM.复合胁迫组。图2同此。CK.Control group;NIT.Nitrite stress group;MP.Microplastic stress group;NM.Nitrite and microplastic composite stress group.e same case in Fig.2.图1 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中氧化损伤指标的影响注：数据上标不同字母表示组间差异显著(P0.05)；后图同此。Fig.1 Effects of nitrite and microplastics stress on oxidative damage index in gills of L.vannameiNote:Different letters on the bar indicate significant differences among the groups(P0.05).The same case in the following figures.abbc00.150.300.450.600.750.90超氧化物歧化酶活性SOD activity/(Umg1)(a)(b)(c)aababb01122334455过氧化氢酶活性CAT activity/(Umg1)abca051015202530354045谷胱甘肽过氧化物酶活性GPx activity/(Umg1)CK NIT MP NMCK NIT MP NMCK NIT MP NM图2 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中抗氧化酶活性的影响Fig.2 Effects of nitrite and microplastics stress on antioxidant enzymes activity in gills of L.vannamei第 2 期邢逸夫等:亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中免疫、解毒代谢和渗透调节相关指标的影响73对表达水平在 3 个胁迫组均显著降低(P0.05，图 3)。2.4 鳃组织渗透调节基因表达分析与 CK 组相比，渗透调节相关酶，如 VATP 基因相对表达水平在 MP 组显著降低(P0.05)。NHE7基因相对表达水平在 NIT 组显著升高(P0.05)。NKA-基因相对表达水平在 3 个胁迫组均显著升高(P0.05)；NKA-基因相对表达水平在 NM 组显著降低(P0.05)。CA 基因相对表达水平在 NIT 和 MP 组均显著降低(P0.05，图 4-a)。与 CK 组相比，渗透调节相关通道蛋白，如TIP4 基因相对表达水平在 NIT 和 NM 组显著升高(P0.05)。CCP、AQP 基因相对表达水平在 3 个胁迫组均显著升高(P0.05，图 4-b)。3 讨论亚硝酸盐是对虾养殖过程中重要的环境因子，水体亚硝酸盐浓度过高会影响对虾生长、免疫和存活15。微塑料由于其特殊的理化性质及在水体中的分布特征，会吸附环境中的有害物质，危害水生动物健康16。鳃作为对虾重要的呼吸器官，是亚硝酸盐毒性效应的主要靶器官，也是微塑料主要的富集部位之一17-19。鳃组织参与对虾渗透调节、氮排泄、免疫功能等生理过程，对对虾维持机体健康有重要意义20。因此，本研究探讨了亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织中免疫和渗透调节的影响。3.1 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中氧化应激指标的影响氧化应激是环境胁迫对水生动物生理健康影响的主要机制之一。环境胁迫会诱导机体产生过量活性氧(ROS)，包括超氧阴离子(O2)、羟基自由基(OH)和 H2O2等。当 ROS 的生成率高于抗氧化酶的中和率时，就会发生氧化应激21-22。过量的ROS 作用于细胞脂质使其过氧化生成 MDA。本研究中，3 个胁迫组对虾鳃中 MDA 和 H2O2浓度均呈上升趋势，表明亚硝酸盐和微塑料胁迫会导致对adbccabbaaaaCYP450GSTCASP-300.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0免疫基因表达水平Immune gene expression level 对照组 CK亚硝酸盐组 NIT微塑料组 MP复合胁迫组 NM图3 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织免疫基因表达的影响Fig.3 Effects of nitrite and microplastics stress on immunegene expression in gills of L.vannameibaabbabbcbaaabbaabacabVATPNHE7NKA-NKA-CA00.51.01.52.02.53.03.54.04.5渗透调节相关酶基因表达水平Osmotic regulation enzymesgene expression level(a)(b)aaabadcbbadabcbbbTIP4CCPCLCAQP00.51.01.52.02.53.03.54.04.5渗透调节通道蛋白基因表达水平Osmotic regulation channel proteingene expression level 对照组 CK亚硝酸盐组 NIT 微塑料组 MP 复合胁迫组 NM图4 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织渗透调节基因表达的影响Fig.4 Effects of nitrite and microplastics stress on osmotic regulation gene expression in gills of L.vannamei74南 方 水 产 科 学第 19 卷虾鳃组织产生氧化应激反应。SOD 是重要的抗氧化酶，可以催化O2分解为 H2O2和 O2，并将 H2O2传递给下游抗氧化酶 CAT 和 GPx，进一步转化为无毒无害的 H2O 和 O2，以维持生物体内氧化还原状态的稳定23-25。本研究中，NIT 和 MP 胁迫组对虾鳃中 SOD和 GPx 活性显著升高，CAT 活性也呈升高趋势，此外 SOD 和 CAT 活性在 NM 组显著升高，且联合胁迫组的水平高于单一胁迫组，表明机体通过增强抗氧化酶活性抵抗亚硝酸盐和微塑料诱导的氧化应激。GPx 活性在 NM 组低于 NIT 和 MP 组，与对照组水平接近，推断单一胁迫诱导了 GPx 活性升高，而二者的复合胁迫降低了单一胁迫的GPx 活性诱导作用，此时氧化应激水平可能已经超出了机体的调节范围26。3.2 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中解毒代谢与细胞凋亡相关基因表达的影响解毒代谢是水生动物应答环境胁迫的重要机制，其中单加氧酶的作用尤为重要。CYP450 是单加氧酶复合体中的末端氧化酶，属于 I 相代谢酶，在解毒代谢酶系中发挥关键作用27。GST 是机体生物转化过程中重要的 II 相代谢酶，同样参与解毒和抗氧化防御过程。研究表明，亚硝酸盐胁迫凡纳滨对虾 48 h 后，对虾血淋巴中 CYP450 基因相对表达水平上调28。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)在亚硝酸盐胁迫 12、24、48 h 后 GST 基因相对表达水平有不同程度的上调29。暴露于聚苯乙烯微塑料 21 d 后，斑马鱼(Danio rerio)幼体 CYP450 基因相对表达水平显著上调30。斑马鱼幼鱼暴露于粒径 10 m 质量浓度为 20 gL1的微塑料中120 h 后，GST 基因相对表达水平显著上调31。本研究中，CYP450 基因相对表达水平在 NIT 和MP 组均显著上调，而 GST 基因相对表达水平在3 个胁迫组中均显著降低，表明对虾机体解毒代谢系统受到胁迫影响，而亚硝酸盐和微塑料诱导的环境应激会损伤机体解毒代谢功能。CASP-3 是一种蛋白酶，其在对虾细胞凋亡过程中起着关键作用32。研究表明，微塑料与重金属铜单因素及联合胁迫条件下，斑马鱼鳃中 CASP-3 基因相对表达水平显著上调33。而本研究中，亚硝酸盐和微塑料单因素及联合胁迫下，对虾鳃中 CASP-3 基因相对表达水平均显著下调，表明胁迫抑制了对虾鳃中的细胞凋亡功能，进而影响机体内环境的稳态。3.3 亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中渗透压调节相关基因表达的影响甲壳动物通过渗透压调节维持体内离子平衡，而鳃在外部介质和血淋巴之间的渗透活性离子(如Na+、Cl和 NH4+)的交换中起着关键作用34。鳃作为微塑料的主要富集器官，当微塑料在鳃上富集时会影响其组织结构，导致渗透调节能力改变1。甲壳动物的离子调节主要是由鳃上皮中 Na+-K+-ATP酶、V-ATP 酶、HCO3-ATP 酶、CA 等多种离子转运酶参与完成35。ATP 酶作为蛋白质家族群，包括 V 型、P 型等。VATP 属于 V 型 ATP 酶，与维持溶酶体酸化有关，而溶酶体稳态失衡是公认的氧化应激导致细胞损伤的标志36。研究表明，盐度胁迫亚马逊沼虾(Macrobrachium amazonicum)后，鳃中 VATP 基因表达水平显著低于对照组34。Na+-K+-ATP 酶(NKA)作为细胞渗透调节的重要组成部分，属于 P 型 ATP 酶蛋白家族，由催化 亚基和糖蛋白 亚基组成，与 H+的排出和阳离子的吸收有关37；NKA 还能和 CA、NHE 等酶共同调节机体酸碱平衡35。CA 可催化 CO2转变为 HCO3，从而增加体内 pH 缓冲物质的含量38。NHE 在机体 pH 过高时，能诱导 Na+与细胞中的 H+交换，排出多余的 H+39。本研究中，MP 组 VATP 基因相对表达水平显著下降，NKA-表达水平均显著上调，NIT 组 NHE7 基因相对表达水平显著上调，NIT 和 MP 组 CA 基因相对表达水平显著下降。VATP 基因表达水平在 MP 组最低，NM 组略高于MP 组，推测微塑料胁迫产生了一定毒性作用，影响鳃组织离子转运功能，而亚硝酸盐刺激了鳃上相关离子转运酶的活性，诱导了机体对微塑料胁迫的生理应答反应。水通道蛋白(AQP)是位于细胞膜上的功能蛋白，在水分运输、离子选择透过性、渗透压调节等过程中起重要作用40。TIP4 能够协助 AQP 实现物质的高效跨膜运转，AQP 和 TIP4 基因的表达水平及活性增强说明环境渗透压向高渗方向变化38。本研究中，各胁迫组对虾鳃中 AQP 和 TIP4 基因相对表达水平均呈上调趋势，由此推测亚硝酸盐和微塑料胁迫均会影响对虾鳃组织水分跨膜运转等功能，进而影响鳃组织渗透调节功能。生物通过形成电位差实现 H+的交换与电信号传导，这一过程还第 2 期邢逸夫等:亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中免疫、解毒代谢和渗透调节相关指标的影响75需要 Cl、Ca2+等离子的参与，也就离不开氯离子通道蛋白(CLC)及钙离子通道蛋白(CCP)的调控作用41。本研究中，对虾鳃中 CLC 基因相对表达水平在 MP 组下调，而在 NIT 和 NM 组上调，CCP基因相对表达水平在各胁迫组均显著上调。由此推测，亚硝酸盐胁迫增强了对虾鳃中 Cl离子通道蛋白功能，微塑料胁迫反而使其功能降低；两种胁迫均会对 Ca2+离子通道蛋白表达产生促进作用。4 结论综上所述，亚硝酸盐和微塑料单因素及联合胁迫均可诱导凡纳滨对虾鳃组织氧化应激、解毒代谢、细胞凋亡以及渗透调节相关指标变化。亚硝酸盐胁迫造成对虾鳃组织生理紊乱，且微塑料会加重亚硝酸盐毒性，影响对虾鳃组织生理功能。因此，对虾高密度养殖中应注意微塑料对养殖动物的负面效应，降低环境因子对凡纳滨对虾生理功能的影响。参考文献：DUAN Y F,ZHANG Y,DONG H B,et al.Effect of dietaryClostridium butyricum on growth,intestine health status and resis-tance to ammonia stress in Pacific white shrimp Litopenaeus van-nameiJ.Fish Shellfish Immunol,2017,65:25-33.1HUANG W T,YIN H,YANG Y Y,et al.Influence of the co-expo-sure of microplastics and tetrabromobisphenol A on human gut:simulation in vitro with human cell Caco-2 and gut microbiotaJ.Sci Total Environ,2021,778:146264.2WANG W N,WANG A L,ZHANG Y J,et al.Effects of nitrite onlethal and immune response of Macrobrachium nipponenseJ.Aquaculture,2004,232(1/2/3/4):679-686.3DUAN Y,LIU Q S,WANG Y,et al.Impairment of the intestinebarrier function in Litopenaeus vannamei exposed to ammoniaand nitrite stressJ.Fish Shellfish Immunol,2018,78:279-288.4HSIEH S L,WU Y C,XU R Q,et al.Effect of polyethylene micro-plastics on oxidative stress and histopathology damages inLitopenaeus vannameiJ.Environ Pollut,2021,288:117800.5SABOROWSKI R,KOREZ P,RIESBECK S,et al.Shrimp and mi-croplastics:a case study with the Atlantic ditch shrimp PalaemonvariansJ.Ecotox Environ Safe,2022,234:113394.6RAGUSA A,SVELATO A,SANTACROCE C,et al.Plasticenta:first evidence of microplastics in human placentaJ.Environ Int,2021,146:106274.7WANG D L,DI Z,WANG L M,et al.Effects of white spot syn-drome virus infection on immuno-enzyme activities and ultra-structure in gills of Cherax quadricarinatusJ.Fish Shellfish Im-8munol,2012,32(5):645-650.FOGUESATTO K,BOYLE R T,ROVANI M T,et al.Aquaporin indifferent moult stages of a freshwater decapod crustacean:expres-sion and participation in muscle hydration controlJ.Comp Bio-chem Physiol A,2017,208:61-69.9LINGREL J B.Na,K-ATPase:isoform structure,function,and ex-pressionJ.J Bioenerg Biomembr,1992,24(3):263-270.10陈亭君.低盐、高亚硝酸盐胁迫日本囊对虾转录组分析及MjTPS 基因克隆和功能研究 D.湛江:广东海洋大学,2022:64-67.11DUAN Y F,XIONG D L,WANG Y,et al.Toxicological effects ofmicroplastics in Litopenaeus vannamei as indicated by an integ-rated microbiome,proteomic and metabolomic approachJ.SciTotal Environ,2020,761(2):143311.12YAN M,LI W,CHEN X F,et al.A preliminary study of the associa-tion between colonization of microorganism on microplastics andintestinal microbiota in shrimp under natural conditionsJ.JHazard Mater,2021,408:124882.13于萍.微塑料对中华绒螯蟹毒性效应的初步研究 D.上海: