第六章 色谱分析导论 仪器分析教材-南京大学.docx

第六章 色谱分析导论

基本要求：
1. 理解混合物中各组分在色谱柱内得到分离的原因
2. 理解柱效率的物理意义及其计算方法
3. 理解速率理论方程对实际分离的指导意义
4. 掌握分离度的计算及影响分离度的重要色谱参数
6．1 色谱法及其分类
6.1.1 色谱法
色谱法(Chromatography)是一种分离分析方法。它是利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。
俄国植物学家M.Tswett于1906年首先提出色谱法。Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上端，然后让洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过。在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下移动。由于色素中各组分的性质的差异，与碳酸钙的作用力大小不同，作用力小的先流出，作用力大的后流出，最后分离成不同颜色的清晰色带。因此称这种方法为色谱法。然后将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管，用刀将各色带切下，对其中的组分用合适的分析方法分别进行测定。这是经典色谱法，各色素的分离过程与其含量测定过程是离线的，即不能连续进行。现代色谱法的分离过程与其含量测定过程是在线的，即连续进行。当一个二组分（A和B）的混合样品在t1时间从柱头加入，随着流动相不断加入，洗脱作用连续进行，直至A和B组分先后流出柱子而进入检测器，从而使各组分浓度转变成电信号后记录在记录纸上，或显示在荧光屏上，或由电脑贮存后打印出来。图6-1（a）为色谱柱内A和B的洗脱过程；（b）则为记录下来的色谱图。一般说，在图上不同位置的峰代表不同的组分，而峰的面积代表各组分的含量。

图6-1 二组分混合样的分离
(a) 柱内洗脱过程； (b) 所记录下来的色谱图
6.1.2 分类
色谱法种类很多，通常按以下几种方式分类。
1．按两相状态分类
在Tswett的实验中，碳酸钙是固定不动的，称为固定相；石油醚是流动的，称为流动相。根据流动相状态，流动相是气体的，称为气相色谱法；流动相是液体的，称为液相色谱法。若流动相为超临界流体，则称为超临界流体色谱法。
根据固定相状态，是活性固体（吸附剂）还是不挥发液体或在操作温度下呈液体（此液体称固定液，它预先固定在一种载体上），气相色谱法又可分为气固色谱法和气液色谱法；同理，液相色谱法也可分为液固色谱和液液色谱法。
2. 按分离原理分类
色谱法中，固定相的性质对分离起着决定性的作用。
根据不同组分在固定液中溶解度的大小而分离的称为分配色谱。气相色谱法中的气液色谱和液相色谱法中的液液色谱均属于分配色谱。
根据不同组分在吸附剂上的吸附和解吸能力的大小而分离的称为吸附色谱。气相色谱法中的气固色谱和液相色谱法中的液固色谱均属于吸附色谱。
3. 按固定相的形式分类
固定相在柱内的称为柱色谱，柱色谱有填充柱色谱和开管柱色谱。固定相填充满玻璃或金属管中的称为填充柱色谱；固定相固定在管内壁的称为开管柱色谱或毛细管柱色谱。
固定相呈平面状的称为平板色谱，平板色谱有纸色谱和薄层色谱。前者以吸附水分的滤纸作固定相，后者以涂敷在玻璃板上的吸附剂作固定相。
按固定相材料分类
根据固定相材料的不同进行分类。以离子交换剂为固定相的称为离子交换色谱。以孔径有一定范围的多孔玻璃或多孔高聚物为固定相的称为尺寸排阻色谱。采用化学键合相（即通过化学反应将固定液分子键合于多孔载体，如硅胶上）的称为键合相色谱。
以上分类总结于表6-1。
表6-1色谱法分类
流动相 名 称 固 定 相 名 称
气体 气相色谱 固 体 气固色谱（gas solid chromatography,GSC）
(gas chromatography,GC) 液 体 气液色谱(gas liquid chromatography, GLC)
液体 液相色谱 * 固体吸附剂 液固色谱(liquid solid chromatography,LSC)
(liquid chromatography,LC) 液 体 液液色谱(liquid liquid chromatography,LLC)
键合固定相 键合相色谱(bonded phase chromatography,BPC)
多孔固体 尺寸排阻色谱(sized exclusion chromatography,SEC)
离子交换剂 离子交换色谱(ion exchange chromatography, IEC)
纸纤维中的水 纸色谱 **(paper chromatography,PC)
固体吸附剂 薄层色谱 **(thin layer chromatography,TLC)
超临界流体 超临界流体色谱 类似LC 超临界流体色谱（supercritical fluid
chromatography,SFC )
* 为泛指名称，目前一般指高效液相色谱，(high performance liquid chromatography,HPLC)
** 为平板色谱，其余均为柱色谱
6.2 色谱流出曲线和术语
6.2.1 色谱流出曲线
在色谱法中,当样品加入后,样品中各组分随着流动相的不断向前移动而在两相间反复进行溶解、挥发，或吸附、解吸的过程。如果各组分在固定相中的分配系数（表示溶解或吸附的能力）不同，它们就有可能达到分离。分配系数大的组分，滞留在固定相中的时间长，在柱内移动的速度慢，后流出柱子，分配系数小的组分则相反。分离后的各组分的浓度经检测器转换成电信号而记录下来，得到一条信号随时间变化的曲线，称为色谱流出曲线，也称为色谱峰，如图6-2所示。理想的色谱流出曲线应该是正态分布曲线。

图6-2 典型色谱流出曲线
(1) 基线 操作条件稳定后,无样品通过时检测器所反映的信号——时间曲线。稳定的基线是一条水平直线，如图6-2中的OO′线。
(2) 死时间t0 不被固定相吸附或溶解的组分，即非滞留组分（如空气，适用于热导检测器或甲烷，适用于火焰离子化检测器）从进样开始到色谱峰顶（即浓度极大）所对应的时间。死时间主要与柱前后的连接管道和柱内固定相之间的空隙体积的大小有关。
(3) 保留时间tR 组分从进样开始到色谱峰顶所对应的时间。
(4) 调整保留时间t′R 扣除死时间后的组分的保留时间。它表示该组分因吸附或溶解于固定相后，比非滞留组分在柱内多滞留的时间（t’R =tR-tO）。
(5）峰高h 色谱峰顶到基线的垂直距离。
(6) 半峰宽 色谱峰高一半处的宽度，又称半宽度。
(7) 峰底宽 从色谱流出曲线两侧拐点所作的切线与基线交点之间的距离，也称基线宽度。
(8) 标准偏差σ 正态分布曲线两侧拐点之间距离的一半,即0.607倍峰高处的色谱峰宽度的一半。σ与半峰宽的关系为：
(6.1)
与峰底宽的关系为：
(6.2)
组分在柱内理想的浓度分布构型可用正态分布曲线方程来表示:

(6.3)
式中,c为时间t时的浓度；F为流动相的体积速度；m为组分的质量；tR为组分保留时间,其对应浓度为cmax。这里的σ是以时间为单位的，也可以长度为单位。
该方程表示组分在柱内的浓度分布状况，σ反映谱带展宽的程度。σ越小，表示谱带展宽的程度越小，亦表示组分浓度相对集中，检测器给出的信号越大。更常用的是由方差σ2来描述谱带展宽程度。
由色谱流出曲线可以实现以下目的:
(1) 依据色谱峰的保留值进行定性分析；
(2) 依据色谱峰的面积或峰高进行定量分析；
(3) 依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色谱柱的分离效能。
6.3 色谱分析基本原理
色谱分离是一个非常复杂的过程,它是色谱体系热力学过程和动力学过程的综合表现。热力学过程是指与组分在体系中分配系数相关的过程；动力学过程是指组分在该体系两相间扩散和传质的过程。组分、流动相和固定相三者的热力学性质使不同组分在流动相和固定相中具有不同的分配系数，分配系数的大小反映了组分在固定相上的溶解——挥发或吸附——解吸的能力。分配系数大的组分在固定相上的溶解或吸附能力强，因此在柱内的移动速度慢。反之，分配系数小的组分在固定相上的溶解或吸附能力弱，在柱内的移动速度快。经过一定时间后，由于分配系数的差别，使各组分在柱内形成差速移行，达到分离的目的。
6.3.1 分配过程
1.分配系数
在色谱分配过程中,假设考虑柱内极小一段的情况(图6-3)。在一定的温度、压力条件下，组分在该一小段柱内发生的溶解—挥发或吸附—解吸的过程称为分配过程。当分配达平衡时，组分在两相间的浓度之比为一常数，该常数称分配系数（或称分布系数）K。
(6.4)

图6-3 色谱柱柱内的分配平衡
分配系数决定于组分和两相的热力学性质。在一定温度下，分配系数K小的组分在流动相中浓度大，先流出色谱柱；反之，后流出色谱柱。两组分K值之比大，（不是指每一组分的K的绝对值越大），是获得良好色谱分离的关键。柱温是影响分配系数的一个重要参数，在其它条件一定时，分配系数与柱温的关系为：
(6.5)

这是色谱分离的热力学基础。式中，△rGm为标准状态下组分的自由能；R为气体常数；Tc为柱温。
组分在固定相中的△rGm 通常是负值，所以分配系数与温度成反比，增加温度，分配系数变小。在气相色谱分离中，柱温是一个很重要的操作参数，温度的选择对分离影响很大，而对液相色谱分离的影响小。
2．分配比
一定的温度、压力条件下，分配达平衡时，组分在两相中的总量之比称分配比k′，又称容量因子。
(6.6)
k′与K的关系为：

(6.7)
或

(6.8)
式中，β为色谱柱的相比；Vm为柱内的流动相体积，也称为柱的死体积（无效体积或孔隙体积），包括固定相颗粒之间和颗粒内部孔隙中的流动相体积；Vs为固定相体积，它指真正参与分配的那部分体积，若固定相是吸附剂、固定液、离子交换剂或凝胶，则分别指吸附剂表面积、固定液体积、离子交换剂交换容量或凝胶孔容。
分配比与分配系数的不同在于分配比不但与组分和两相性质有关，而且还与两相体积有关。
6.3.2 保留值
保留值是色谱分离过程中的组分在柱内滞留行为的一个指标,它可以用保留时间、保留体积和相对保留值等表示。保留值与分配过程有关，受热力学和动力学因素的控制。
1．保留体积和调整保留体积
保留体积VR表示在组分的保留时间内所流过的流动相体积:
(6.9)
Fc为柱内流动相体积流速（mL·min-1）。流动相流速大，相应的保留时间短，保留体积不变，所以VR与Fc无关。
调整保留体积V′R表示扣除死体积后的保留体积，因为死体积不能反映组分在固定相中的保留行为。调整保留体积可表示为：
(6.10)
V’R与Fe也无关。Vm为死体积，它与死时间和柱出口的流动相体积流速有关：
(6.11)
以上所指的死体积既包括了柱内死体积，也包括柱外死体积，如柱前后连接管道等。
必须注意区分组分和流动相的线速度（cm·s-1）：

(6.12)

(6.13)
L为柱长。
2．基本保留方程
基本保留方程可表示为：

(6.14)
它表示组分保留时间与柱长、流动相速度、分配比、分配系数和两相体积之间的关系。也可以用保留体积表示：
(6.15)
式（6.15）是色谱基本保留方程的又一形式，同样适用于任何色谱过程。该式表示某组分从柱后流出所需要的流动相体积，包括柱的死体积以及在组分滞留在固定相中的t′R时间内所流过的流动相体积。后者的大小决定于该组分的分配系数和固定相体积，即KVs。
由式(6.14）得：

(6.16)

由此可知，组分的分配比也等于组分调整保留时间与死时间之比，它可以直接从色谱图上求得。
3．相对保留值
用相对保留值(α)可以消除由于流动相流速、柱长、填充情况等不能完全重复而带来的实验误差。在柱温和固定相性质不变的条件下，相对保留值不变。
相对保留值定义为：
(6.17)

α2,1用来讨论固定相对组分的分离能力。α2,1的计算用后流出柱的组分的调整保留值除以先流出柱的组分的调整保留值。α主要决定于固定相性质，其次是色谱柱温度。α值越大，表示固定相对组分的选择性越高，则两组分分离得越开。α等于1时，两组分重叠。
6.3.3 塔板理论和速率理论
1．塔板理论
Martin等人于1952年提出的塔板理论是将一根色谱柱当作一个精馏塔，用塔板概念来描述组分在色谱柱内的分配行为。塔板的概念是从精馏中借用来的，可以理解为极小的一段色谱柱。塔板理论是一种半经验理论，但它能成功地解释色谱流出曲线呈正态分布。
塔板理论假定：(1)塔板与塔板之间不连续。(2)塔板之间无分子扩散。(3)组分在每块塔板的两相间的分配平衡瞬时达到，达到一次分配平衡所需的最小柱长称为理论塔板高度。(4)一个组分在每块塔板上的分配系数相同。(5)流动相以不连续的形式加入，即以一个一个的塔板体积加入。把色谱柱比作精馏塔，视作由许许多多小段组成。连续的色谱过程视作一个小段中的两相平衡过程的重复，每小段代表一块塔板。组分进入色谱柱后，在每块塔板上进行两相间的分配。塔板数越多，组分在柱内两相间达到分配平衡的次数也越多，柱效越高，分离就越好。在气相色谱柱内，理论塔板数一般达103-106。塔板数越多，其流出曲线越接近于正态分布曲线。根据塔板理论可计算柱子的塔板数，以用来评价一根柱子的柱效。当然，色谱柱中并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数。理论塔板数可按下式计算：

(6.18)

或

(6.19)

从上式可以看出，理论塔板数决定于组分保留值和色谱峰宽度，式中dR为保留距离。
假设色谱柱长为L，则每块理论塔板的高度可按下式计算：

(6.20)
显然，理论塔板高度相当于单位理论塔板所占的柱长度，它与柱长无关，因此在比较柱效时，采用理论塔板高度更可取。理论塔板数越多，理论塔板高度越小，色谱峰越窄，表明柱效越高。特别要注意塔板数计算时，量纲应一致。保留时间乘以记录器纸速即为保留距离；保留时间乘以流动相速度即为保留体积。
在采用塔板数评价一根色谱柱的柱效时，必须指明组分、固定相及其含量、流动相及操作条件等。在色谱柱使用过程中应定期测量柱子的理论塔板数，检查其柱效是否降低，以便及时采取措施，延长柱子使用寿命。
2．速率理论
当一组分从柱头瞬时加入，其柱截面上浓度分布构型呈极窄的“塞子”状。若在理想状态下，分子不扩散，则理想的色谱峰应呈脉冲形，然而实际上得到的往往是展宽的色谱峰。这用塔板理论是无法解释的，因为塔板理论忽略了在色谱分配过程中，组分在两相中的扩散和传质的动力学因素。1956年Van Deemter等人提出了速率理论，以后Giddings等人又进一步加以补充完善。速率理论把塔板理论中的塔板高度概念与组分在两相间的扩散和传质联系起来，采用随机模式描述组分在柱内的分离过程。当用正态分布描述色谱动力学过程的特征时，用σ2作为色谱峰展宽的指标。组分在柱内的展宽受四种动力学过程的控制，这四种过程是：涡流扩散、纵向分子扩散、流动相传质和固定相传质，它们对峰展宽的贡献分别以σ2e , σ21、σ2m 和σ2s表示。
(1) 涡流扩散 当色谱柱内的组分随流动相在固定相颗粒间的空隙间穿行，朝柱出口方向移动，如果固定相颗粒不均匀，则组分在穿过这些空隙时碰到大小不一的颗粒而必须不断地改变方向，于是在柱内形式了紊乱的“涡流”流动，使流经障碍情况不同的流路中的分子先后到达柱出口，而使谱带展宽，如图6-4所示。涡流扩散使色谱峰展宽的程度可表示为：
(6.21)
式中，λ为填充不规则因子；dp为固定相颗粒平均直径；L为柱长。

图6-4 涡流扩散使峰展宽
由上式可知，固定相颗粒大小是影响涡流扩散的主要原因。一般来说，颗粒细，有利于填充均匀，但太细的颗粒会增加柱的阻力，使渗透性变坏。λ与填充技术和固定相颗粒均匀度有关。对填充柱，颗粒间空隙大小越不一致，λ越大，涡流扩散越严重。涡流扩散与组分、流动相性质以及线速度无关。
减小涡流扩散的办法是选择细而均匀的颗粒，采用良好的填充技术和尽可能使用短柱。
(2) 纵向分子扩散 由于组分的加入，在柱的轴向上形成浓度梯度，因此当组分以“塞子”形式随流动相移动时，分子必然会自发地向前和向后扩散。这种由浓度梯度引起的其方向沿着轴向进行的扩散，称为纵向分子扩散。它使谱带展宽的情况如图6-5所示。展宽程度可表示为：

(6.22)
式中，γ为弯曲因子；Dm为组分在流动相中的扩散系数；u为流动相线速度。

图6-5 纵向分子扩散使峰展宽
(a) 柱内谱带浓度分布构型； (b) 相应的响应信号
弯曲因子反映了固定相颗粒的几何形状阻碍分子扩散的程度，一般小于1。Dm与组分和流动相的性质及柱温有关。Dm与流动相的相对分子质量的关系为 ，因此，在气相色谱中，对同一组分若用氢气作流动相（亦称载气）产生的纵向分子扩散要比用氮气时严重。组分在液体中的扩散系数约为气体中的1/105,所以在液相色谱中,纵向分子扩散一般可忽略。Dm随柱温升高而增加，而与柱压成反比。由上式还可看出，流动相线速越小，柱越长，组分在柱内的滞留时间越长，纵向分子扩散程度就越大。
欲使纵向分子扩散减少，应选择球状颗粒和相对分子质量较大的物质作流动相，并适当增加流线相线速，采用短柱和较低的柱温。
(3) 流动相传质阻力 在组分从流动相扩散到流动相与固定相界面的传质过程中所受到的阻力称为流动相传质阻力，如图6-6所示。它使谱带展宽，其展宽程度可表示为：

(6.23)
式中，ω为由柱填充性质决定的因子，其余符号同前。

图6-6 组分在流动相中的传质
组分从流动相扩散到两相界面需要一定的时间，该时间与扩散时经过的距离平方成正比，与组分扩散系数成反比，而扩散经过的路径决定于固定相颗粒间空隙的大小，即决定于dp的大小。由于组分处在颗粒空隙间的不同位置，因此到达两相界面的时间不同，从而使谱带展宽。dp越大，组分到达两相界面的时间越长，谱带展宽越严重。L增加，组分停留在流动相中的时间增加，传质阻力相应增加。流动相线速增加造成组分难以接近两相界面，使传质阻力增加，引起谱带展宽。
采用细颗粒的固定相，增大组分在流动相中的扩散系数，适当降低流动相线速，选用短柱等均可使流动相传质阻力尽可能地减小。
(4) 固定相传质阻力
组分从两相界面扩散到固定相内部，达到分配平衡后又返回两相界面时受到的阻力，称为固定相传质阻力。固定相传质阻力使谱带展宽程度可表示为：

(6.24)
式中，q为与固定相性质、构型有关的因子；k′为分配比；df为有效平均液膜厚度。当使用多孔固定相时，df可用dp代替；DS为组分在固定液中的扩散系统，其余符号同前。
固定相传质速率受组分在固定相内扩散速率的控制。当组分达到分配平衡后的瞬间内，流动相仍不断地载着其中的组分向前移动，使固定相中的组分来不及返回流动相而落后于谱带平衡浓度的位置。当流动相和固定相间重新建立平衡后，谱带更展宽，如图6-8所示。液膜厚度决定于固定液含量的大小，固定液含量低，df降低，组分在固定液内扩散的时间缩短，有利于分配平衡的建立，但含量过低，易使载体表面的活性中心暴露，造成峰拖尾现象。柱长和流速的影响与流动相传质阻力类似。

图6-7 固定相传质对谱带展宽的影响
(a)两相达平衡时， (b)达平衡后的瞬间内
使固定相传阻力减小的办法是采用低含量固定液，以减小固定液液膜厚度，但使k′也减小。选用低粘度固定液，增大组分在固定液中的扩散系数，适当提高柱温及降低流速，并尽可能使用短柱，以提高柱效。
3．速率理论方程
在色谱分离中，柱内谱带展宽的因素不是独立的，而是同时发生的，而且方差具有加和性。因此，在柱长相等的情况下，柱效的高低可用峰的宽窄来衡量。峰窄，σ2小，H小，柱效高，故塔板高度又可表示为单位柱长内的谱带展宽程度。注意这里的σ是以长度为单位。

(6.25)
将σ2e 、σ21 、σ2m 、和σ2s相应值代入上式，得：

(6.26)

上式是速率理论方程，即Van Deemter方程，亦简称范氏方程。当除u以外的实验参数都视作常数时，Van Deemter方程可简写为:

(6.27)
常数A为涡流扩散项系数；B为纵向分子扩散项系数；C为流动相传质阻力和固定相传质阻力项系数之和。
由该式知，流动相线速u一定时，仅在A、B、C较小时，塔板高度H才能较小，柱效才较高；反之柱效较低，色谱峰将展宽。
对气相色谱，以不同流速下测得的塔板高度H对流动相线速作图，得如图6-8所示的H—u曲线。由图6-8可得出以下结论：(1)涡流扩散与流动相线速无关。(2)在低流速区时，纵向分子扩散占主导地位，此时应选用相对分子质量较大的N2、Ar作为载气，使组分在流动相中有较小的扩散系数。(3)在高流速区时，传质阻力占主导地位，此时应选用相对分子质量较小的H2、He作为载气，使组分有较大的扩散系数，以提高柱效。

图6-8 H—u曲线
该H—u曲线有一最低点，与最低点所对应的塔板高度H值最小，（即Hmin），该点所对应的线速为最佳线速uopt，此时可得到最高的柱效。
最小塔板高度Hmin和最佳线速Uopt可通过对式6-27微分，并令其等于0，求得：

(6.28)

(6.29)
Van Deemter方程对选择 色谱最佳分离条件具有普遍指导意义，它表明了色谱柱填充的均匀程度，载体粒度的大小，流动相的种类和线速，固定相液膜厚度及柱温等对柱效的影响。
例1 长度相等的两色谱柱，其Van Deemter方程中的常数A、B、C如下表所示：
A/cm B/cm2·s-1 C/s
柱Ⅰ 0.16 0.40 0.27
柱Ⅱ 0.080 0.20 0.040

试计算：
(1) 柱Ⅱ的柱效是柱Ⅰ的几倍?
(2) 柱Ⅱ的最佳线速是柱Ⅰ的几倍?
解: (1) 柱效由式(6.29)计算的最小塔板高度来表示。对柱Ⅰ：

柱Ⅱ：

所以，柱Ⅱ的柱效是柱Ⅰ的3.2倍。
(3) 由式(6.28)计算最佳线速。对柱Ⅰ：

柱Ⅱ：

所以，柱Ⅱ的最佳线速是柱Ⅰ的1.9倍。
6.3.4 影响谱带展宽的其他因素
1．非线性色谱
速率理论虽然比较全面地考虑了两相中的传质和扩散，但仍假定等温线是线性的。事实上，等温线经常是非线性的。特别在吸附色谱中，由于等温线的非线性决定了分配系数不是常数，而是浓度的函数，使谱带的高浓度区域（中心附近）和低浓度区域（前沿和尾部）的分子的移动速率不等，造成色谱峰“拖尾”或“伸舌”现象，从而使峰展宽。
2． 活性中心的影响
由于载体表面不完全惰性，即使涂布少量固定液后，在它表面存在的活性中心（如酸或碱作用中心）对极性强的组分仍会产生吸附，使这些组分释放的速度慢于其他分子而造成拖尾。解决办法是将载体预处理，除去或减少这些活性中心。
3． 柱外效应
在色谱柱以外的某些因素，使谱带展宽，降低柱的实际分离效率的现象称为柱外效应。造成柱外效应的因素有两类：柱前后死体积和与进样有关的技术。前者包括较大的气化器体积、连接管体积和检测器死体积等；后者包括进样速度慢，进样量大及气化温度不够高等。这些因素对组分在两相中的分配系数不起任何作用，反而使组分初始带宽增加，加剧分子扩散，造成谱带展宽。因此，必须将柱外效应抑制到最低程度。
6.3.5 分离度
分离度是对两色谱峰分离程度的量度。图6-9说明柱效和选择性对分离度的影响。图中（a）两组分的保留值相差大，表示固定相对它们有足够的选择性，但柱效差，色谱峰宽。(b)中两色谱峰窄，柱效高，但距离相差小，说明固定相的选择性差，α小。(c)中两色谱峰窄，又有一定的距离，柱效和选择性都好。由此可知，柱效或柱选择性只能说明两组分在柱中的分离情况的一个方面，因此采用分离度来表示两色谱峰的实际分离程度。

图6-9 柱的柱效和选择性
分离度又称分辨率或总分离效能指标，它定义为相邻两组分的色谱峰保留值之差与峰底宽总和的一半的比值：

(6.30)

式中，下标（1）和（2）分别为第一和第二组分。分离度的另一种表示方法是用半峰宽代替峰底宽：

(6.31)

两组分的保留时间的差别取决于固定相的热力学性质，差别越大，表示固定相对组分的选择性越高；两峰底宽越窄，表示柱效越高。
分离度可全面反映柱选择性和柱效，它是相邻两色谱峰实际分离程度的量度，如图6-10所示。对于两个峰高相同的对称峰，达到基线分离时，Rs=1.5，此时，两组分的分离程度达99.87%，因此用Rs =1.5作为相领两峰完全分离的指标。当Rs=1.0时，两峰分离程度达97.72%。如果两峰的高度相差10倍，当Rs=1.0时，低含量组分的分离程度只有88%，这是因为两峰交叉“污染”时，在低含量组分中夹杂的在两峰等高时的相同高含量组分所占的比例增大。利用式（6-30）可直接从色谱图上求出分离度。

图6-10 面积和峰高均相等的两对称色谱峰的分离
(a) 分离度=1.0； (b) 分离度=1.5
对分离度的要求可以根据分析目的而定。在一般分析中，使用峰面积定量，RS=1.0已可满足要求。如用峰高定量，RS 还可小些，但对于制备色谱，为了保证纯度，要求有足够大的RS。
6.3.6 基本分离方程
分离度表达式（6-30）未表明影响分离度的因素。若假定相邻两组分（1）和（2）的峰底宽相等，利用式(6.14)、(6.18)以及式(6.30)，经推导可得：

(6.32)

上式为色谱基本分离方程式。式中下标2为相邻两组分中的第二组分。该方程可视为三个因素的函数：柱效因子n，柱选择性因子α和容量因子k′，这三个参数可以直接从色谱图上计算得到。
当n、k′为0或α为1时，分离度为零。增加n或k′和α值对分离有利。
(1) 柱效的影响 柱长L∝n，增加柱长可以提高分离度，但会延长分析时间，而且峰宽也会随保留时间的延长而增加。因此为了增高柱效，用减小塔板高度H的办法比增加柱长要好。为了达到实际工作中所需要的分离度，根据下式可以计算出在给定分离度下应具有的塔板数n。

(6.33)

(2) 分配比的影响 增加k′可以增加分离度，根据式(6.14)，k′值越大，分析时间越长，峰越展宽。通常k′值选择在1-10范围内。改变分配比的方法有：改变柱温或改变流动相性质和组成，或改变固定相的含量。
(3) 相对保留值 α越大，柱选择性越好，对分离越有利。分离度对α值微小变化很敏感，见表6-2。A从1.01增加至1.10，约增加9%，而分离度增加9倍。
表6-2 相对保留值α对分离度影响
α
1.01
1.02
1.03
1.04
1.05
1.10
1.20
1.30
1.50
2.00
3.00

0.010
0.020
0.029
0.038
0.048
0.091
0.167
0.231
0.333
0.500
0.667
n
Rs=1.5, k′=2
826281
210681
95377
54756
35721
9801
2916
1514
730
324
182
L/m
(H=0.6mm)
495
126
52
33
21
5.8
1.7
1.0
0.44
0.19
0.11
改变α值的方法有：改变固定相性质，或改变流动相性质及组成，或采用较低柱温，从而增大α值。在气相色谱法中，通过改变固定相来改善α值，因为流动相是惰性的。在液相色谱中，则往往改变流动相来改变α值，因为其固定相过于昂贵。
由上可知，在n、k′及α三个参数中，增加a对改进分离最有效，但也不是越大越好。当α值趋近1时，增加α，对改进R2显著，但当a值超过1.5后，α的改变对Rs的影响较小。
当固定相选定后，即α一定，k′大对分离有利。当k′超过10时，对Rs的改进不明显，而保留时间却大大延长。
例2 在3.0m色谱柱上，分离组分X和Y的色谱图如下，计算X