新疆某肉牛场母牛妊娠损失相关疫病调查_冯梦迪_.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):1 3 3-1 3 6P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e新疆某肉牛场母牛妊娠损失相关疫病调查 收稿日期:2 0 2 2-0 3-0 1 基金项目:新疆自治区乡村振兴产业发展科技行动项目(2 0 2 0 N C 0 0 1);新疆自治区自然科学基金项目(2 0 1 9 D 0 1 A 5 8)作者简介:冯梦迪(1 9 9 7-),女,河南平舆人,硕士,主要从事幼畜疾病防治研究。*通讯作者冯梦迪,马雪连,孙亚伟,易鹏飞,吴 静,王 凡,陈玉珠,杨朝辉,钟 旗,姚 刚*(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐8 3 0 0 5 2;2.新疆畜牧科学院研究所,新疆乌鲁木齐8 3 0 0 1 1)摘 要:母牛妊娠损失主要由于疫病、管理不当、应激等发生流产和死胎,是影响养牛业健康发展的主要危害。为了解引起牛场母牛妊娠损失的主要疫病,对新疆某安格斯肉牛繁育场2 0 2 0年-2 0 2 1年全年妊娠损失情况进行调查,采集1 5 0头有妊娠损失史母牛的血液、肛拭子及鼻拭子,采用R T-P C R/P C R、E L I S A方法检测传染性鼻气管炎病毒(I B R V)和牛病毒性腹泻病毒(B V D V);采用虎红平板凝集试验(R B T)、试管凝集试验(S AT)和半抗原琼脂扩散试验(NH-G D)检测布鲁氏菌抗体。现场调查发现,2 0 2 0年-2 0 2 1年该牛场配孕母牛98 6 0头,产活犊94 3 8头,累计妊娠损失4 2 2头,妊娠损失率为4.2 8%。妊娠损失母牛中I B R V抗体阳性率为6 3.3 3%,抗原阳性率为4 2.6 7%;B V D V阳性率为1.3 3%;布鲁氏菌R B T阳性率为1 0.6 7%,S AT和NH-G D阳性率为0。表明该场母牛妊娠损失的主要疫病因素可能为I B R V。因此,建议使用I B R灭活苗或B V D-I B R二联灭活苗免疫健康牛群,剔除B V D持续感染牛;加强布鲁氏菌抗体监测,制定并实施完善牛场生物安全风险控制措施,降低母牛妊娠损失。关键词:安格斯牛场;母牛;妊娠损失;疫病调查中图分类号:S 8 5 7.2 2文献标识码:B文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 1 3 3-0 4 母牛的妊娠损失是指胎儿或胚胎与母体之间由于疾病、中毒、应激、营养和饲养管理不当等多种因素的影响下发生的胎儿或胚胎病理变化,造成妊娠中断,最终胎儿死亡的现象,主要表现为流产和死胎1。导致妊娠损失的主要疫病有牛传染性鼻气管炎(B o v i n ei n f e c t i o u sr h i n o t r a c h e i t i s,I B R)、牛病毒性腹泻(B o v i n ev i r a ld i a r r h e a,B V D)和布鲁氏菌病(B r u c e l l o s i s)等。世界动物卫生组织曾将I B R列为B类疫病2,我国明确规定,凡是进出口的牛及其相关制品,必须进行I B R V的检测。B V D是由牛病毒性腹泻病毒(B V D V)引起的 一种急性、热性传染病3;2 0世纪8 0年代初首次证实B V D V在我国存在4,新疆部分地区牛群B V D V抗体平均阳性率在7 0%左右5。布鲁氏菌病是危害公共卫生和家畜养殖业的人兽共患病之一,以牛和羊的感染最为严重6。布鲁氏菌可引起怀孕母畜发生流产,常见于妊娠的中后期,且流产后长期不孕7。本研究针对2 0 2 0年-2 0 2 1年新疆某安格斯肉牛场母牛妊娠损失进行调查,对妊娠损失相关疫病I B R、B V D和布鲁氏菌病进行病原检测,筛查导致母牛妊娠损失的主要原因,以期为防控牛场母牛妊娠损失提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品 针对新疆某安格斯肉牛繁育场2 0 2 0年-2 0 2 1年母牛妊娠损失情况进行临床调查,并采集新疆某规模化肉牛繁育场有妊娠损失史的母牛鼻拭子、肛拭子、抗凝血以及全血样品各1 5 0份,全血分离血清,抗凝血4保存,其他样品置-2 0保存,用于实验室进行后续检测。1.1.2 试剂 天根血液/细胞/组织基因组D NA提取试剂盒,2T a qP C R M i x,北京天根生化科技有限公司产品;D NA M a r k e rD L20 0 0,北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品;Om e g a组织D NA提取试 剂 盒,Om e g aB i o-T e k公 司 产 品;T r i z o l,I n-v i t r o g e n公司产品;反转录试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司产品;1T A E缓冲液,扬州优邦生物科技有限公司产品。1.1.3 主要仪器设备 P C R扩增仪,德国E p p e n-d o r f公司产品;电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;凝胶成像仪(U n i v e r s a lH o o d),B i o-R a d公司产品;离心机,上海凌仪生物科技有限公司产品。DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.0071.2 方法1.2.1 I B R V的检测 1.2.1.1 I B R VP C R检测 根据Om e g a组织D NA提取试剂盒操作说明书对采集的1 5 0份鼻拭子提取D NA。参 照G e n B a n k已 公 布 的I B R V序 列 利 用P r i m e r5.0设 计 引 物,I B R V-F:5 -C T C T A C C G-C A C G G G C A C C T-3,I B R V-R:5 -G C G G C T C T CG T C T C G C A-3;扩增片段长度为3 6 0b p。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。反应体系为:P C RM i x1 2.5L,上、下游引物各1L,模板1L,用d d H2O补至2 5L。P C R扩增条件为:9 55m i n;9 53 0s,5 83 0s,7 23 0s,共3 5个循环;7 2再延伸1 0m i n。P C R产物经2 0g/L琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.1.2 I B R V-A bE L I S A检测 采用牛传染性鼻气管炎病毒抗体(I B R V-A b)E L I S A检测试剂盒,按照操作说明,根据显色的深浅,并用酶标仪在4 5 0n m波长下测定吸光度(O D值),判断样品是否含有I B R V-A b。根据样品的O D值判断结果。试验有效性:阳性对照孔O D值平均值1.0 0;阴性对照孔O D值平均值0.1 5。临界值=阴性对照孔平均值+0.1 5;样品O D值临界值,样品为阳性。1.2.2 B V D VR T-P C R检测 用T r i z o l法提取1 5 0份肛拭子样品的R N A,参照G e n B a n k已公布的B V D V序 列 用P r i m e r5.0设 计 的 引 物,B V D V-F:5 -A G T C G T C A G T G G T T C G A C-3,B V D V-R:5 -T C-C A T G T G C C A T G T A C A-3;扩增片段长度为2 0 1b p。R T-P C R检测方法检测B V D V,引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系为:P C R M i x1 2.5L,上、下游引物各1L,模板1L,用d d H2O补至2 5L。P C R反应条件为:9 5 5m i n;9 5 3 0s,5 8 3 0s,7 2 3 0s,共3 5个循环;7 2 再延伸1 0m i n。P C R产物经2 0g/L琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.3 布鲁氏菌的检测 对1 5 0份血清样品进行布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(R B T)和试管凝集试验(S AT),按照文献8 进行结果判定,阳性血清再用特异性高的半抗原-琼脂扩散试验(NH-G D)进行最终确诊。1.3 数据处理与统计分析用E x c e lMAT L A BO r i g i n数据处理软件对检测结果进行统计,用分布式计算集群分析和分类汇总数据。2 结果2.1 妊娠损失临床调查结果该牛场分别在2 0 2 0年3月和6月进行全群布鲁氏 菌 病 免 疫;在2 0 2 1年2月4月 全 群 免 疫B V D V,5月 底 免 疫 效 价 检 测 结 果 显 示,该 牛 场B V D V抗体阳性率8 7.5%;2 0 2 1年7月9月对部分牛进行了I B R V免疫。本研究于2 0 2 0年1 0月1 8日至2 0 2 1年1 0月9日,调查新疆某安格斯肉牛繁育场的妊娠母牛定胎头数98 6 0头。累计妊娠损失4 2 2头次,妊娠损失率为4.2 8%。其中流产2 1 4头次,流产占妊娠损失的5 0.7 1%;死胎2 0 8头次,死胎占妊娠损失的4 9.2 9%。流产平均在胎天数1 7 5d,死胎平均在胎2 5 3d(表1)。2.2 妊娠损失相关疫病检测结果2.2.1 I B R V检测结果 检测样本数为1 5 0头份,E L I S A阳性9 5头份,阳性检出率为6 3.3 3%;P C R阳性6 4头份,阳性检出率为4 2.6 7%。部分妊娠损失母牛鼻拭子阳性样本P C R检测结果见图1。在3 6 0b p处出现I B R V特异条带。I B R V抗体阳性率为6 3.3 3%(9 5/1 5 0),抗原阳性率为4 2.6 7%(6 4/1 5 0)。对相应样本的I B R V抗原与抗体检测结果进行比较表明,发现抗原呈阴性、抗体呈阳性较多,占检测样本总数的3 9.3 3%(5 9/1 5 0),结果见表2。2.2.2 B V D V检测结果 用P C R技术对1 5 0份粪便样品进行病原检测,共检出2份阳性B V D V,阳性率为1.3 3%,部分P C R电泳结果见图2。2.2.3 布鲁氏菌检测结果 对1 5 0份血清样品检测结果显示,R B T检测阳性率为1 0.6 7%,S AT检测阳性率为0,对经R B T检测阳性的1 6份样品再进行NH-G D检测,阳性率为0(表3)。表1 母牛妊娠损失的季节变化T a b l e1 E f f e c to f s e a s o n so np r e g n a n c y l o s so f c o w s季节S e a s o n定胎头数/nF o e t u sN o.产活犊数/nL i v ec a l v i n gN o.流产头数/nA b o r t i o nN o.死胎头数/nS t i l l b i r t hN o.妊娠损失头数/nL o s sN o.妊娠损失率/%L o s sr a t e春S p r i n g36 1 234 8 46 86 01 2 83.5 4夏S u mm e r13 2 712 7 12 13 55 64.2 2秋A u t u m n25 9 724 5 87 26 71 3 95.3 5冬W i n t e r23 2 422 2 55 34 69 94.2 6合计T o t a l98 6 094 3 82 1 42 0 84 2 24.2 8431动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)M.D NA标准D L20 0 0;N C.阴性对照;A C.阳性对照;11 5.样品P C R检测结果M.D NA M a r k e rD L20 0 0;N C.N e g a t i v ec o n t r o l;A C.P o s i t i v ec o n t r o l;1-1 5.P C Rd e t e c t i o nr e s u l t so f s a m p l e s图1 I B R VP C R扩增产物琼脂糖凝胶电泳图F i g.1 A g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i so fP C Ra m p l i f i c a t i o np r o d u c t so f I B R VM.D NA标准D L20 0 0;A C.阳性对照;N C.阴性对照;11 5.样品P C R检测结果M.D NA M a r k e rD L20 0 0;A C.p o s i t i v ec o n t r o l;N C.n e g a t i v ec o n t r o l;1-1 5.P C Rd e t e c t i o nr e s u l t so f s a m p l e s图2 B V D VP C R部分样品扩增产物琼脂糖凝胶电泳图F i g.2 A g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i so fP C Ra m p l i f i c a t i o np r o d u c t so fB V D V表2 I B R抗原抗体检测结果比较T a b l e2 C o m p a r i s o no f I B Ra n t i g e na n da n t i b o d yd e t e c t i o nr e s u l t s抗原A n t i g e n抗体A n t i b o d y样品数/nS a m p l eN o.占比/%P r o p o r t i o n+3 62 4.0 0+-2 81 8.6 7-2 71 8.0 0-+5 93 9.3 3总计T o t a l1 5 01 0 0.0 0表3 布鲁氏菌病检测结果T a b l e3 B r u c e l l o s i s t e s t r e s u l t s检测方法D e t e c t i o nm e t h o d被检样本数/nT e s t e ds a m p l en u m b e r阳性数/nP o s i t i v en u m b e r阳性率/%P o s i t i v er a t eR B T1 5 01 61 0.6 7S A T1 5 000NH-G D1 603 讨论引起母牛妊娠损失的因素很多,一般分为传染性因素和非传染性因素。传染性因素9包括细菌、病毒、真菌、原虫等,非传染性因素有营养、遗传、应激等因素1 0。对该牛场从饲料质量角度分析,2 0 2 1年8月部分圈舍出现大面积腹泻,通过检测饲草,查看现场,判断与饲喂草料配比不规范有关。及时调整饲料配比,8月底至1 0月流产2头,与期间共计3 6头流产头数相比,整改措施显著。新疆地区冬夏温差较大,饲料保存不当可造成霉变或营养流失,妊娠母牛中毒或营养缺乏发生妊娠损失。该牛场发生妊娠损失的母牛均为头胎牛,易发生妊娠损失。秋季发生妊娠损失的母牛为5.3 5%,比春季高1.8 1%,比夏季高1.1 3%,比冬季高1.0 7%。该牛场在2月4月B V D V疫苗注射后6 0d内流产早产比例达1 2%,说明B V D V疫苗注射与妊娠损失有一定的关系。对免疫效价检测显示有其他环境菌感染的可能性。B V D V和I B R V均可通过宫内感染引起妊娠母牛流产、死产、不孕等症状,是导致母牛发生妊娠损失的重要病毒病原体1 1。本调研结果发现引起新疆某肉牛场母牛流产的病原主要是I B R V和布鲁氏菌。I B R V抗体阳性率为6 3.3 3%(9 5/1 5 0),该肉牛场应重视I B R V防控,加强对I B R V的免疫。该牛场进行了B V D V全群免疫,是否为一过性感染有待531冯梦迪等:新疆某肉牛场母牛妊娠损失相关疫病调查确定,所以对于B V D的防控不能松懈。对采集样品进行布鲁氏菌病检测,R B T阳性率为1 0.6 7%,S AT和NH-G D无阳性结果,说明该肉牛场2 0 2 0年-2 0 2 1年度布鲁氏菌病防控工作良好。本调查发现该肉牛养殖场存在B V D V和I B R V感染,这两种病原体在母牛的妊娠损失中存在协同作用的可能1 2。建议用I B R灭活苗或B V D-I B R二联灭活苗免疫健康牛,剔除B V D V的持续性感染牛;同时加强布鲁氏菌病抗体监测,对布鲁氏菌抗体阳性牛定期复检,如再有阳性出现,淘汰阳性牛。制定并实施牛场的疫苗免疫和生物安全风险防控措施,以期降低母牛妊娠损失。参考文献:1 闫海燕,王海霞.妊娠母牛胚胎早期死亡或流产的病因分析及防控措施J.饲料博览,2 0 1 9(6):1.2 世界动物卫生组织(O I E).O I E陆生动物诊断试验与疫苗手册M.北京:中国农业出版社,2 0 1 2(7):8 2 7-8 4 5.3 赵霞玲,牛家强,次仁央金,等.牦牛腹泻病毒B V D V,B C V,B R V流行病学调查J.高原农业,2 0 2 0,4(3):5.4 李佑民,刘振润.牛病毒性腹泻-黏膜病病毒株(长春1 8 4)的分离和鉴定J.兽医大学学报,1 9 8 3(3):1 1 3-1 2 0.5 王治才,刘崇向.牛腹泻病病毒感染羔羊的调查J.中国预防兽医学报,1 9 9 2(3):4 1-4 2.6 安红雨.母牛常见细菌性流产及防治措施J.畜牧兽医科技信息,2 0 2 0,5 1 9(3):1 0 4-1 0 4.7 石鹏飞.牛羊布病流行传播的风险与防控对策J.吉林畜牧兽医,2 0 2 1,4 2(4):1.8 G B/T1 8 6 4 6-2 0 1 8,动物布鲁氏菌病诊断技术S.9 袁立春.引起妊娠母牛流产的常见传染病的诊断及防控J.现代畜牧科技,2 0 2 0(3):9 6-9 81 0 K E S HAVA R Z IH,S A D E GH I-S E F I DMA Z G IA,GHO R B A-N IG,e t a l.E f f e c to fa b o r t i o no nm i l kp r o d u c t i o n,h e a l t ha n dr e p r o d u c t i v ep e r f o r m a n c eo fH o l s t e i nd a i r yc a t t l eJ.A n i mR e p r o dS c i,2 0 2 0,2 1 7:1 6.1 1 C L O TH I E RG,WA P E NAA R W,K E NNYE,e ta l.F a r m e r s a n dv e t e r i n a r ys u r g e o n s k n o w l e d g e,p e r c e p t i o n sa n da t t i t u d e st o w a r d sc a t t l e a b o r t i o n i n v e s t i g a t i o n s i n t h eUKJ.V e tR e c,2 0 2 0.1 2 郭启勇,柳国锁,吴心华.奶牛流产现状分析J.中国奶牛,2 0 2 0,3 5 8(2):4 2-4 4.I n v e s t i g a t i o na n dA n a l y s i so nD i s e a s e sR e l a t e dt oP r e g n a n c yL o s so fC o w si nB e e fC a t t l eF a r mi nX i n j i a n gF E NG M e n g-d i,MAX u e-l i a n,S UNY a-w e i,Y IP e n g-f e i,WUJ i n g,WANGF a n,CHE NY u-z h u,YANGC h a o-h u i,Z HONGQ i,YAOG a n g(1.C o l l e g eo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e,X i n j i a n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,U r u m q i,X i n j i a n g,8 3 0 0 5 2,C h i n a;2.I n s t i t u t eo fA n i m a lS c i e n c e,X i n j i a n gA c a d e m yo fA n i m a lS c i e n c e,U r u m q i,X i n j i a n g,8 3 0 0 1 1,C h i n a)A b s t r a c t:P r e g n a n c y l o s so f c o w s i sm a i n l yd u e t od i s e a s e s,i m p r o p e rm a n a g e m e n t,s t r e s s,e t c.A b o r t i o na n ds t i l l b i r t ha r e t h em a i nh a z a r d sa f f e c t i n gt h eh e a l t h yd e v e l o p m e n to fc a t t l e i n d u s t r y.I no r d e r t ou n d e r s t a n dt h em a i nd i s e a s e so fp r e g n a n c yl o s so fc o w si nc a t t l ef a r m,t h ep r e g n a n c yl o s so fa nA n g u sb e e fc a t t l eb r e e d i n gf a r mi nX i n j i a n gf r o m2 0 2 0t o2 0 2 1w a si n v e s t i g a t e d.B l o o d,a n a ls w a b sa n dn a s a ls w a b so f1 5 0c o w sw i t hah i s t o r yo fp r e g n a n c yl o s sw e r ec o l l e c t e d,a n di n f e c t i o u sr h i n o t r a c h e i t i sv i r u s(I B R V)a n db o-v i n ev i r a l d i a r r h e av i r u s(B V D V)w e r ed e t e c t e db yR T-P C R/P C Ra n dE L I S A.T i g e r r e dp l a t e a g g l u t i n a t i o nt e s t(R B T),t u b ea g g l u t i n a t i o nt e s t(S AT)a n dh a p t e na g a rd i f f u s i o nt e s t(NH-G D)w e r eu s e dt od e t e c tb r u c e l l o s i sa n t i b o d y.O n-t h e-s p o t i n v e s t i g a t i o nf o u n dt h a tf r o m2 0 2 0t o2 0 2 1,t h e r ew e r e98 6 0p r e g n a n tc o w s,94 3 8 l i v e c a l v e s a n d4 2 2c u m u l a t i v ep r e g n a n c y l o s s e s,w i t hap r e g n a n c y l o s s r a t eo f 4.2 8%.T h ep o s i-t i v er a t e so f I B R Va n t i b o d ya n da n t i g e n i np r e g n a n t c o w sw e r e6 3.3 3%a n d4 2.6 7%r e s p e c t i v e l y.T h ep o s i-t i v er a t eo fB V D Vw a s1.3 3%;T h ep o s i t i v e r a t eo fR B Ti nb r u c e l l o s i sw a s1 0.6 7%,a n dt h ep o s i t i v e r a t e so fS ATa n dNH-G Dw e r e0.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t I B R Vw a s t h em a i ne p i d e m i c f a c t o ro f c o wp r e g n a n c yl o s s i nt h i sf a r m.T h e r e f o r e,i t i ss u g g e s t e dt h a tI B Ri n a c t i v a t e dv a c c i n eo rB V D-I B Ri n a c t i v a t e dv a c c i n es h o u l db eu s e dt o i mm u n i z eh e a l t h yc a t t l ea n de l i m i n a t eB V Dc o n t i n u o u s l yi n f e c t e dc a t t l e,a n ds t r e n g t h e-n i n gt h em o n i t o r i n go fb r u c e l l o s i sa n t i b o d y,f o r m u l a t i n ga n di m p l e m e n t i n gt h er i s kc o n t r o lm e a s u r e so fc a t t l e f a r mb i o s a f e t y,a n dr e d u c i n gt h ep r e g n a n c y l o s so f c o w s.K e yw o r d s:A n g u sb e e f c a t t l e f a r m;c o w;p r e g n a n c y l o s s;i n v e s t i g a t i o no f e p i d e m i cd i s e a s e631动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)