小檗碱对人卵巢癌细胞SKOV3抑制作用的研究_魏巍.pdf

12022 年第 9 卷第 11 期实用妇科内分泌电子杂志论 著小檗碱对人卵巢癌细胞SKOV3抑制作用的研究魏巍1，张秀智2，孙丽丽1，陈艺华1，张帆1，张青3，张吉4，李纯1（1.大连大学附属中山医院 生殖中心，辽宁 大连 116001；2.大连大学附属中山医院 骨科实验室，辽宁 大连 116001；3.大连大学附属中山医院 中心实验室，辽宁 大连 116001；4.大连大学，辽宁 大连 116622）【摘要】目的 研究小檗碱对人卵巢癌细胞的抑制作用，并探讨其调控机制。方法 培养人卵巢癌细胞SKOV3，给予不同浓度的小檗碱，通过CCK8法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞周期和凋亡，Transwell法检测细胞迁移，Western-Blot检测细胞中Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Vimentin、E-cadherin蛋白表达。结果 小檗碱剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞增殖；通过下调Cyclin D1表达调控细胞周期；小檗碱可明显诱导 SKOV3 细胞凋亡，下调 Bcl-2并上调 Bax表达；此外，小檗碱通过调节Vimentin和E-cadherin的表达抑制细胞迁移。结论 小檗碱剂量依赖性地抑制SKOV3细胞增殖和迁移，促进细胞周期停滞，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤效果。【关键词】小檗碱；SKOV3细胞；抗肿瘤；细胞凋亡；细胞迁移Anti-tumor effect of berberine on human ovarian cancer cell line SKOV3Wei Wei1,Zhang Xiuzhi2,Sun Lili1,Chen Yihua1,Zhang Fan1,Zhang Qing3,Zhang Ji4,Li Chun1(1.Reproductive Center,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 116001,China;2.Department of Orthopedics,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 116001,China;3.Central Laboratory,Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University,Dalian 116001,China;4.Dalian University,Dalian 116622,China)【Abstract】Objective To investigate the anti-tumor effect of berberine on human ovarian cancer cells and its regulatory mechanism.Methods Human ovarian cancer cell line SKOV3 was cultured and given berberine at different concentrations.Cell proliferation was detected by CCK8 assay,flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis,Transwell method was used to detect cell migration,and Western-Blot was used to detect the protein expression of Cyclin D1,Bcl-2,Bax,Vimentin and E-cadherin.Results Berberine inhibited ovarian cancer cell proliferation in a dose-dependent manner.The cell cycle was regulated by down-regulating Cyclin D1 expression.Berberine could induce apoptosis of SKOV3 cells,down-regulate Bcl-2 and up-regulate Bax expression.In addition,berberine inhibits cell migration by regulating the expression of Vimentin and E-cadherin.Conclusion Berberine can inhibit the proliferation and migration of SKOV3 cells in a dose-dependent manner,promote cell cycle arrest,induce cell apoptosis,and achieve anti-tumor effect.【Key words】Berberine;SKOV3 cells;Anti-tumor;Cell apoptosis;Cell migration卵巢癌的恶性度及致死率在妇科恶性肿瘤中一直居于首位。该病起病隐匿，早期缺乏典型症状和成熟的诊断方法，多数患者直至晚期才被发现。目前，手术治疗联合辅助性化疗仍是卵巢癌最主要的治疗方法1。铂类与紫杉醇的联合化疗方案是卵巢癌术后化疗的一线方案，但不良反应严重，5年生存率小于30%2。现阶段，临床暂无理想的抗卵巢癌药物，因此从天然植物中探索新药成为了国内外研究的重点。小檗碱（BBR）又称黄连素，是从毛茛科植物黄连、芸香科植物黄柏等中提取的一种异喹啉生物碱，具有抗炎、抗心律失常等广泛的药理作用。多年来，小檗碱治疗胃肠道疾病的安全性已得到证实3，其潜在的抗肿瘤能力受到广泛关注。1986年，首次报道小檗碱DOI：10.3969/j.issn.2095-8803.2022.11.001基金项目：大连市医学科学研究计划项目（编号1811101）通信作者：李纯，E-mail：22022 Vol.9 No.11Electronic Journal of Practical Gynecological Endocrinology论 著在杀鱼菌素诱发期皮肤癌中的抗肿瘤作用4。此外，小檗碱对宫颈癌、食道癌、胃癌、结肠癌、黑色素瘤均有明显的抑制作用5-9。但小檗碱对卵巢癌的抑制作用还有待进一步研究，尤其是关于细胞迁移方面。因此，本研究通过流式细胞术及Western-Blot等方法观察小檗碱对肿瘤细胞周期和凋亡的调控作用，并进一步通过Transwell法检测小檗碱对SKOV3细胞迁移的影响，探讨小檗碱抗卵巢癌的效果，为其用于卵巢癌的治疗提供实验和理论依据。同时，为卵巢癌临床治疗提供一种新的思路。现报道如下。1 材料与方法1.1 材料来源小檗碱购自Solarbio公司；卵巢癌 SKOV3 细胞株购于上海中国科学院细胞库；胎牛血清（Hyclone，Logan，UT，美国），RPMI 1640培养液（Gibco，CA，美国）；CCK8检测试剂盒购自Roche公司；AnnexinV-FiTC和PI染色法检测试剂盒购自日本DOJINDO公司；Transwell小室购自美国corning公司；Bcl-2、Bax抗体购自Abbkine公司；Vimentin和E-cadherin抗体购自Cell Signaling公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 将SKOV3细胞接种于75 cm2培养瓶，用含10%FBS的RPMI-1640培养基于37、5%CO2的培养箱中培养，待细胞铺满瓶底，用1 ml胰酶消化传代。1.2.2 CCK8法取100 l对数生长的SKOV3细胞悬液接种于96孔板中（8000个细胞/孔）。培养24 h后给药处理，分为空白组（只含培养液，不加药物）、0.01、0.1、1、10、100 mol/L的小檗碱组，孵育72 h吸除培养液，每孔中加入CCK8溶液，继续于培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定其在450 nm处的吸光度。存活率=（实验组平均吸光度值/正常对照组平均吸光度值）100%。1.2.3 Transwell法 对数生长期的细胞于96孔板中用无血清的1640培养，并按CCK8法中分组，培养24 h后，用胰蛋白酶消化细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度至5105/ml；接种细胞，取细胞悬液100 l加入Transwell上室；于37、5%CO2的培养箱中培养24 h；细胞染色，计数不同处理组的细胞数，结果进行统计。1.2.4 流式细胞术检测细胞周期取对数生长期的SKOV3细胞，分别加入0、1、10、100 mol/L的小檗碱处理24 h后，用胰酶消化细胞制备单细胞悬液。1000 g离心35 min，沉淀细胞。加入约1 ml预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞。用预冷的75%乙醇4固定过夜。离心沉淀细胞，小心吸除上清，用冷PBS 洗涤离心。重复 3次。加入500 l PI染液混匀后4避光孵育30 min，通过流式细胞仪检测细胞周期情况。1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期的SKOV3细胞，分别给予0、1、10、100 mol/L的小檗碱处理24 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞300g离心5 min，收集细胞；用预冷1PBS重悬细胞，500g离心5 min，洗涤细胞；用100 l 的1Binding Buffer调整浓度为 1106个/ml 细胞悬液；加入5 l的Annexin V-FITC和PI染色液混匀后，避光，室温孵育15 min。加入400 l的1Binding Buffer。通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。1.2.6 Western-Blot方法取对数生长期的SKOV3细胞，分别加入0、1、10、100 mol/L的小檗碱处理48 h后，用1裂解液裂解，以-actin为内参，行Western-blot。具体方法如下：用酶标仪测定提取的蛋白浓度，以确保每孔加样量相等。进行SDS-PAGE凝胶电泳（凝胶浓度为10%分离胶、4%浓缩胶）分离，然后电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭60 min。根据抗体说明书配置所需的一抗（Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Vimentin、E-cadherin），4孵育过夜。用TBST洗3次，再用相对应的二抗兔抗或者鼠抗室温反应1 h，TBST洗膜3次，避光ECL显色。1.3 统计学方法每组实验均重复3次以上。采用SPSS 10.0统计学软件对数据进行统计分析。检验数据符合正态分布后，以均数标准差（xs）表示计量资料，组间比较采用t检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 小檗碱对SKOV3细胞生长的抑制作用以0.01、0.1、1、10、100 mol/L的小檗碱处32022 年第 9 卷第 11 期实用妇科内分泌电子杂志论 著理SKOV3细胞72 h，小檗碱浓度越高对细胞增殖的抑制作用越显著，其中100 mol/L的小檗碱组与正常组比较，差异有统计学意义（P0.05）。见图1。图1 不同浓度小檗碱对SKOV3 细胞增殖的影响2.2 小檗碱对SKOV3细胞周期的影响100 mol/L小檗碱组G1期细胞所占比例较对照组明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。见图2A。用Western-Blot方法检测各组细胞中Cyclin D1的表达，结果表明，与对照组相比，小檗碱明显抑制SKOV3细胞中Cyclin D1蛋白的表达，这种调节作用呈明显剂量-效应关系（P0.05）。见图2B。图2 不同浓度小檗碱对SKOV3 细胞周期的影响 注：A.给予黄连素24 h后评估各组细胞周期。B.用Western-Blot法测定小檗碱处理48 h后cyclin D1的蛋白水平。*P0.05，n=32.3 小檗碱对SKOV3细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果表明，小檗碱促进SKOV3细胞凋亡呈现剂量依赖性，与对照组相比，100 mol/L小檗碱处理组凋亡率显著增加，差异有统计学意义（P0.05）。见图3A。Western-Blot结果显示，与正常组相比，100 mol/L小檗碱显著下调Bcl-2蛋白表达水平，同时上调Bax蛋白表达水平，差异有统计学意义（P0.05）。见图3B。图3 不同浓度小檗碱对SKOV3 细胞凋亡的影响 注：A.流式细胞术检测细胞凋亡，测定各组细胞凋亡的相对百分比。B.小檗碱处理48 h后，用Western-Blot法分析细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax的表达情况。*P0.05，n=342022 Vol.9 No.11Electronic Journal of Practical Gynecological Endocrinology论 著2.4 小檗碱对SKOV3细胞体外迁移的影响Transwell检测结果显示，与对照组相比，100 小檗碱组SKOV3细胞从小室上层迁移到下层的数目明显减少，差异有统计学意义（P0.05），这表明小檗碱可抑制SKOV3细胞的体外迁移过程。见图4A。此外，与未给药组相比，经100 mol/L小檗碱处理SKOV3细胞48 h后，Vimentin 蛋白表达减少，E-cadherin蛋白的表达增加，差异有统计学意义（P0.05），且这种调节作用呈浓度依赖性。见图4B。图4 小檗碱对SKOV3 细胞体外迁移的影响 注：A.用Transwell法和结晶紫法观察细胞迁移情况，人工计算细胞迁移数（20）。B.用Western-Blot法检测Vimentin和E-cadherin蛋白水平。*P0.05，n=33 讨论卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，是一种死亡率极高的妇科癌症10。该病的发生发展机制尚不明确，以强增殖、强迁移能力及高复发率为特征。因此，寻找有效的抗肿瘤药物，尤其是能抑制卵巢癌增殖迁移及促进其凋亡的药物，对卵巢癌患者的治疗有重要意义。本研究通过CCK8法检测，结果表明，小檗碱可显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖，且这种抑制作用具有明显的剂量-效应关系。细胞周期异常与肿瘤的发生发展密切相关。抗肿瘤药物可通过调控细胞周期，抑制细胞增殖，进而抗肿瘤。已有研究证明，小檗碱对细胞周期的调控与细胞类型相关。小檗碱能够阻滞胃癌、食管癌细胞于G2/M期进而抑制癌细胞增殖11，12。而在肝癌、乳腺癌、前列腺癌中，小檗碱可选择性地阻滞细胞于G1期13-15。本研究结果显示，小檗碱处理24 h后检测SKOV3细胞周期分布，发现与正常组相比小檗碱组G1期细胞数浓度依赖性升高。这表明小檗碱能显著阻滞卵巢癌细胞于G1期。此外，有研究表明，Cyclin D1是重要的细胞周期调节蛋白，能够促进细胞从G1期转化为S期，其过度表达会促进细胞过度增殖16。本研究通过Western-Blot检测发现，小檗碱能下调卵巢癌SKOV3细胞Cyclin D1蛋白的表达水平。该结果表明，小檗碱调控细胞周期可能是通过减少G1期相关调控蛋白Cyclin D1的表达而实现，进而抑制卵巢癌细胞过度增殖。这需要进一步的研究来证实。肿瘤的发生发展，不仅与肿瘤的不断生长有关，还与肿瘤细胞的死亡率有关。在本研究中，流式细胞仪检测到小檗碱能剂量依赖性地诱导卵巢癌细胞凋亡。其中Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是重要的促细胞凋亡基因，参与多种肿瘤凋亡的调控17。已有研究表明小檗碱可通过调节Bax、Bcl-2的表达，诱导结肠癌、前列腺癌的凋亡18。本研究中蛋白定量检测发现，小檗碱可明显增加促凋亡基因Bax的蛋白表达，降低抗凋亡基因Bcl-2的表达水平，且呈现出浓度依赖性。该结果表明，小檗碱通过调控Bcl-2/Bax的表达，诱导SKOV3细胞凋亡，从而减少肿瘤细胞的数量，达到抗肿瘤的效果。肿瘤细胞转移增加了治疗肿瘤的难度和复杂性。高转移率是卵巢癌的主要特征之一，目前临床上尚无有效抑制卵巢癌转移的特异性药物。有研究报道，小檗碱能有效抑制乳腺癌、肺癌、前列腺癌等癌细胞的迁移19，20。在本研究中，小檗碱能减少卵巢癌细胞从小室上层迁移到下层，该结果表明小檗碱能有效抑制卵巢癌细胞体外迁移。上皮间质转化（EMT）与上皮性肿瘤发生转移与侵袭密切相关。在肿瘤细胞发生EMT过程中，不仅伴随着细胞形态学和功能的改变，还存在着相关生物标志物的改变，如上皮标志物E-cadherin表达减弱、间皮标志Vimentin 表达增强等。本研究通过Western-Blot检测表明小檗碱能显52022 年第 9 卷第 11 期实用妇科内分泌电子杂志论 著著降低Vimentin 蛋白的表达，增加E-cadherin的表达，且呈剂量依赖性。该结果表明小檗碱组细胞迁移能力的下调可能与上皮-间质转化相关。这为小檗碱抑制卵巢癌迁移机制的研究提供了新的方向，当然这需要更多的研究来证实。综上所述，小檗碱通过抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡以及抑制细胞迁移在体外产生抗卵巢癌的作用，且小檗碱抗卵巢癌作用在浓度100 mol/L范围内具有剂量依赖性。后续将围绕高浓度小檗碱的抗癌效果、提高小檗碱生物利用率及小檗碱临床抗肿瘤效果观察等开展进一步研究。随着研究的不断深入，必将更全面、更精确地了解小檗碱的抗肿瘤机制及效果，为卵巢癌的临床治疗提供理论依据，最终为肿瘤的临床诊断、治疗和预防带来新策略。参 考 文 献1 Oronsky B,Ray CM,Spira AI,et al.A brief review of the management of platinum-resistant-platinum-refractory ovarian cancerJ.Med Oncol,2017,34(6):103.2 Hoppenot C,Eckert MA,Tienda SM,et al.Who are the long-term survivors of high grade serous ovarian cancerJ.Gynecol Oncol,2018,148(1):204-212.3 Mirhadi E,Rezaee M,Malaekeh-Nikouei B.Nano strategies for berberine delivery,a natural alkaloid of BerberisJ.Biomed Pharmacother,2018,37(104):465-473.4 Nishino H,Kitagawa K,Fujiki H,et al.Berberine sulfate inhibits tumor-promoting activity of teleocidin in two-stage carcinogenesis on mouse skinJ.Oncology,1986,43(2):131-134.5 Guamn Ortiz Luis,Paolo L,Micol T,et al.Berberine,an epiphany against cancerJ.Molecules,2014,19(8):12349-12367.6 Ayati SH,Fazeli B,Momtazi-Borojeni AA,et al.Regulatory effects of berberine on microRNome in cancer and other conditionsJ.Crit Rev Oncol Hematol,2017,35(116):147-158.7 Jin H,Jin X,Cao B,et al.Berberine affects osteosarcoma via downregulating the caspase-1/IL-1 signaling axisJ.Oncol Rep,2016,37(2):729-736.8 Jiang SX,Qi B,Yao WJ,et al.Berberine displays antitumor activity in esophageal cancer cells in vitroJ.World J Gastroenterol,2017,23(14):2511-2518.9 Wu K,Yang QJ,Mu YQ,et al.Berberine inhibits the proliferation of colon cancer cells by inactivating Wnt/-catenin signalingJ.Int J Oncol,2012,41(1):292-298.10 Hoon SD,Miseon K,Kidong K,et al.Major clinical research advances in gynecologic cancer in 2016:10-year special editionJ.J Gynecol Oncol,2017,28(3):e45.11 Eo SH,Kim JH,Kim SJ.Induction of G2/M arrest by berberine via activation of PI3K/Akt and p38 in human chondrosarcoma cell lineJ.Oncol Res,2015,22(3):147-157.12 Alessandro A,Marco N,Mercedes GG,et al.Cell-specific pattern of berberine pleiotropic effects on different human cell linesJ.Sci Rep,2018,8(1):10599.13 Wang N,Wang XB,Tan HY,et al.Berberine suppresses cyclin D1 expression through proteasomal degradation in human hepatoma cellsJ.Int J Mol Sci,2016,17(11):1899.14 Hashemi-Niasari F,Rabbani-Chadegani A,Razmi M,et al.Synergy of theophylline reduces necrotic effect of berberine,induces cell cycle arrest and PARP,HMGB1,Bcl-2 family mediated apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cellsJ.Biomed Pharmacother,2018,37(106):858-867.15 Huang ZH,Zheng HF,Wang WL,et al.Berberine targets epidermal growth factor receptor signaling to suppress prostate cancer proliferation in vitroJ.Mol Med Rep,2015,11(3):2125-2128.16 Wang Y,Li W,Wang Z,et al.Genistein upregulates cyclin D1 and CDK4 expression and promotes the proliferation of ovarian cancer OVCAR-5 cellsJ.Clin Chim Acta,2019,19:100-105.17 Huska JD,Lamb HM,Hardwick JM.Overview of BCL-2 Family Proteins and Therapeutic PotentialsJ.Methods Mol Biol,2019,47(1877):1-21.18 Gong C,Hu X,Xu Y,et al.Berberine inhibits proliferation and migration of colorectal cancer cells by downregulation of GRP78J.Anticancer Drugs,2020,31(2):141-149.19 Kim S,Lee J,You D,et al.Berberine suppresses cell motility through downregulation of TGF-1 in triple negative breast cancer cellsJ.Cell Physiol Biochem,2018,45(2):795-807.20 Liu CH,Tang WC,Sia P,et al.Berberine inhibits the metastatic ability of prostate cancer cells by suppressing epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)-associated genes with predictive and prognostic relevanceJ.Int J Med Sci,2015,12(1):63-71.