响应面法优化桑寄生总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究_何春玫.pdf
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1、广西农学报Journal of Guangxi Agriculture第 37 卷第 6 期Vol.37,No.6532022 年 12 月December,2022响应面法优化桑寄生总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究何春玫 李绿霞 覃晓(广西农业职业技术大学,广西 南宁 530007)摘要:【目的】为广西桑寄生的开发利用和文化传承提供数据参考。【方法】以广西农业职业技术大学内桂花树桑寄生为原材料,采用响应面法优化超声辅助乙醇提取桑寄生黄酮的工艺。在单因素实验基础上,选择超声功率、超声时间和乙醇浓度三个因素,以黄酮提取量为响应值,采用 Design Expert 10.0.4 软件设计的 Box
2、-Behnken 响应面试验优化桑寄生黄酮提取的工艺条件,并采用 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除试验评估桑寄生乙醇提取物的体外抗氧化活性。【结果】结果表明,桑寄生黄酮提取的最优工艺条件为超声功率 143.71 W,超声时间 31.96 min,乙醇浓度 48.05%,预测黄酮的提取量为 49.1279 mg/g。在体外抗氧化活性试验中,桑寄生乙醇提取液对 DPPH 自由基有良好的清除能力,其 IC50为 6.24 g/mL,是同浓度抗坏血酸活性的 3.33 倍。【结论】桑寄生的乙醇提取液具有良好的抗氧化活性,可作为天然抗氧化剂加以利用。关键词:桑寄生;黄酮;超声波辅助;响
3、应面优化;抗氧化活性中图分类号:R284.2 文献标识号:A 文章编号:1003-4374(2022)06-0053-08The Research of the Optimization of Extraction and Antioxidant Activily of Total Flavoroids from Taxillia Herba by Response Surface MethodHe Chun-mei,Li L-xia,Qin Xiao(Guangxi Vocational University of Agricultural,Nanning,Guangxi 530007,Ch
4、ina)Abstract:【Objective】It provides data reference for the development,utilization and cultural inheritance of taxiui herba in Guangxi.【Method】Response surface methodology was used to optimize the ultrasonic-assisted ethanol extraction process of flavonoids from Taxilli Herba in Guangxi Agricultural
5、 Vocational University of Agricultural.On the basis of single factor experiment,ultrasonic power,ultrasonic time and ethanol concentration were selected as three factors,and the extraction amount of flavonoids was used as the response value.Box-Behnken designed by Design Expert 10.0.4 Software was a
6、pplied to design the response surface test to optimize the extraction conditions of flavonoids from Taxilli Herba.The antioxidant activity of Taxilli Herba ethanol extract in vitro was evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging test.【Result】The results showed that the op
7、timum extraction conditions of flavones were:ultrasonic power 143.71 W,ultrasonic time 31.96 Min,ethanol concentration 48.05%,and the yield of flavones was 49.1279 mg/g.In the experiment of antioxidant activity,the ethanol extract has good scavenging activity for the DPPH free radical,IC50 is 6.24 g
8、/mL,3.33 times the activity of Vc at the same 收稿日期:2022-07-20 修回日期:2022-08-10基金项目:广西农业职业技术学院学生创新课题(项目编号:xsk21071)。第一作者简介:何春玫,女,1975 年生,硕士,教授,主要从事植物活性物质提取与应用研究工作。广西农学报542022 年concentration.【Conclusion】The ethanol extract of Taxilli Herba has good antioxidant activity and can be used as a natural anti
9、oxidant.Key words:taxilli herba,flavonoids,ultrasonic assisted,response surface optimization,antioxidant activity在广东、广西地区,人们有将采摘的寄生枝梗或芽叶煮成凉茶饮用的习惯,其中有广西梧州的桑寄生茶曾于 1992 年被列为中华传统食品保健茶类。1桑寄生的主要有效成分是黄酮类化合物,具有较强的抗氧化活性,具有补肝肾、强筋骨、祛风湿、安胎元等功效,被广泛用于中医各类处方。2,3桑寄生主要分布于热带和亚热带地区,朱开昕等4在开展广西桑寄生的分布及其寄主的调查时发现,广西桑寄生在桂南、
10、桂东、桂中等区域分布普遍,且广西桑寄生具有广寄性,寄主植物有 36 个科 150多种,桑寄生寄主植物和采摘部位不同,其黄酮的含量也不相同,药用功能存在差异。5,6本研究以广西农业职业技术大学内桂花树寄主的桑寄生为原材料,采用超声波辅助乙醇提取桑寄生黄酮,为广西桑寄生的开发利用和文化传承提供数据参考。1 材料与仪器1.1 材料和试剂桑寄生茶叶:采摘于广西农业职业技术大学,寄主为桂花树,阴干。芦 丁 标 准 品(纯 度 98%,生 产 批 号LC220726,CAS#153-18-4,合肥博美生物科技有限责任公司);无水乙醇、氯化铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、抗坏血酸(Vc)、1,1-二苯基-2-三硝基
11、苯肼(DPPH)等,均为国产分析纯;纯化水(自制)。1.2 仪器设备JP-1000B 型高速多功能粉碎机(永康市久品工贸有限公司),KQ-300DB 型数控亲水性超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),EL204 型电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司,V-1800 型分光光度计 翱艺仪器(上海)有限公司,UPT-II-20T 型优普系列超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)。2 试验方法2.1 芦丁标准曲线的绘制储备液配制:精密称取芦丁标准品 0.02g 于小烧杯中,加 60%乙醇 2030mL,水浴加热使其完全溶解,冷却至室温后,完全转移至 100mL 容量瓶中,以 60%乙醇定容,摇
12、匀,该储备液芦丁含量为 0.2mg/mL。标准工作液配制:精密移取上述储备液 0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL分别置于 25mL 比色管中,各加水至 6mL,各加5%NaNO2溶液 1mL,摇匀,静置反应 6min。各加10%AlCl3溶液 1mL,摇匀,静置反应 6min。各加4%NaOH 溶液 10mL,定容至刻度线,摇匀,静置反应 15min。以芦丁空白液为参比液,在 510nm 下测定各溶液的吸光度值 A。以吸光度 A510为纵坐标(y)、测定液芦丁的质量(x)为横坐标绘制标准曲线并拟合得到回归方程(1)。y=0.4411x-0.0022(
13、R2=0.9992)(1)式中,y 为溶液的吸光度 A510,x 为溶液中总黄酮质量(mg)。2.2 桑寄生黄酮的提取工艺和提取量的计算2.2.1 提取工艺将阴干的桑寄生茶叶去梗除杂质后粉碎,过 60目筛,混匀后密封避光保存,备用。精密称取一定质量桑寄生茶叶细粉于小锥形瓶中,加入一定量的一定浓度乙醇,摇匀。塞上胶塞,设置一定的时间和温度进行超声提取,过滤,取适当滤液按 2.1 进行显色,在 510nm 下测定吸光度A510。根据回归方程(1)和公式(2)计算总黄酮质量 C 和总黄酮提取量。总黄酮提取量(mg/g)=mCVn10-3100(2)式中,C 为测定液中总黄酮质量(g),V 为提取液体
14、积(mL),n 为稀释倍数,m 为桑寄生茶叶细粉质量(g)。2.2.2 稳定性实验按 2.2.1,随机选取进行三份不同提取参数的桑寄生黄酮提取液,显色后,在 510nm 波长下测定60min 内的吸光度值。每隔 5 分钟测量一次,结果如图 1 所示。结果表明,在 60min 内,吸光度值呈缓慢下降趋势,20min 内三个浓度溶液的吸光度均55何春玫 李绿霞 覃晓:响应面法优化桑寄生总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究第 6 期为最大值的 99%以上,60min 时的吸光度占最大值的 97%左右,为减少显色时间引起的误差,后续实验均在显色后 20min 内完成吸光度的测定。图 1 不同工艺条件显色液
15、稳定试验结果 0.220.230.240.250.260.270.280204060AbsorbanceTime(min)1232.3 单因素对桑寄生黄酮提取的影响实验根据参考文献选择合适的影响因素进行单因素实验。7-102.3.1 超声时间的影响选择乙醇浓度 50%,液料比 501,提取温度60,超声功率 150W 为固定参数,设置自变量超声时间为 10min、20min、30min、40min、50min,按 2.2.1 测定吸光度 A510,计算黄酮提取量。2.3.2 提取温度的影响选择乙醇浓度 50%,液料比 501,超声功率150W,超声时间 30min 为固定参数,设置自变量提取温
16、度为 20、30、40、50、60,按 2.2.1测定吸光度 A510,计算黄酮提取量。2.3.3 超声功率的影响选择乙醇浓度 50%,液料比 501,提取温度60,超声时间 30min为固定参数,设置自变量超声功率为 120W、150W、180W、210W、240W,按 2.2.1 测定吸光度 A510,计算黄酮提取量。2.3.4 乙醇浓度的影响选择超声功率 150W,液料比 501,提取温度 60,超声时间 30min 为固定参数,设置自变量乙醇浓度为 30%、40%、50%、60%、70%,按 2.2.1测定吸光度 A510,计算黄酮提取量。2.3.5 液料比的影响选择超声功率 150W
17、,乙醇浓度 50%,提取温度 60,超声时间 30min 为固定参数,设置自变量液料比为 401、501、601、701、801,按 2.2.1 测定吸光度 A510,计算黄酮提取量。2.4 响应面优化实验基于单因素对桑寄生黄酮提取的实验结果及分析,选择超声功率、超声时间、乙醇浓度等影响较显著的 3 个因素,并以它们为自变量,桑寄生黄酮提取量为响应值,应用 DesignExpert10.0.4 软件设计的 Box-Behnken 试验因素及水平表11-14见表 1。表 1 Box-Behnken 试验因素及水平表11-14因素编码水平-101超声功率(W)超声时间(min)乙醇浓度(%)ABC
18、2050180256021030702402.5 验证优化条件按响应面优化试验方案模型拟合获得的最佳工艺条件,进行 3 次重复性实验,计算黄酮提取量,并将结果取平均值后,与模型给出的理论最佳数据进行比较,验证该模型的可靠性。2.6 抗氧化性实验以抗坏血酸作为阳性对照,拟采用桑寄生茶叶的乙醇提取物对 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除试验结果来评估其体外抗氧化活性。根据参考文献的方法15-18进行实验操作,精密称取 0.016gDPPH,以无水乙醇完全溶解后,于100mL 容量瓶中定容,摇匀。该 DPPH 溶液浓度为0.4mmol/L。按 2.4 最佳工艺提取桑寄生黄酮,测定
19、提取量。精密移取提取滤液 0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1mL 于比色管中,分别用无水乙醇定容至 10mL,再移取稀释液2.0mL2份,分别加入上述DPPH溶液2.0mL和无水乙醇 2.0mL,混合摇匀,室温下避光反应30min,以无水乙醇为参比液,于 510nm 处分别测得吸光度A1和 A2。移取2.0mL蒸馏水代替样品溶广西农学报562022 年液,加入上述DPPH 溶液,室温下避光反应 30min,测得吸光度值 A0。根据公式(3)计算 DPPH 自由基清除率,并计算 IC50。IC50越小,说明该物质体外抗氧
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