生物化学实验讲义.pdf

漳州师院生物科学与技术系 漳州师院生物科学与技术系 生物实验教学中心生物实验教学中心 实验目录实验目录 实验一实验一 生化实验基础知识生化实验基础知识.1 实验二实验二 总氮量的测定凯氏（总氮量的测定凯氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法.3 实验三 Folin-酚法测定蛋白质含量实验三 Folin-酚法测定蛋白质含量.5 实验四实验四 甲醛法滴定法测定氨基氮甲醛法滴定法测定氨基氮.7 实验五 氨基酸的分离鉴定纸层析法实验五 氨基酸的分离鉴定纸层析法.9 实验六 离子交换柱层析法分离氨基酸实验六 离子交换柱层析法分离氨基酸.11 实验七实验七 血清蛋白醋酸纤维膜电泳血清蛋白醋酸纤维膜电泳.13 实验八 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法鉴定胰岛素实验八 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法鉴定胰岛素.15 实验九 酵母实验九 酵母RNA的分离及组分鉴定的分离及组分鉴定.22 实验十实验十 核酸的定量测定定磷法核酸的定量测定定磷法.25 实验十一实验十一 用正交法测定几种因素对酶活力的影响用正交法测定几种因素对酶活力的影响.28 实验十二实验十二 肝脏谷丙转氨酶活力测定肝脏谷丙转氨酶活力测定.32 实验十三 维生素C的含量测定实验十三 维生素C的含量测定.35 附录附录.38 附录一 植物样品的采取、处理与保存附录一 植物样品的采取、处理与保存.38 附录二 实验室安全及防护知识及其常识附录二 实验室安全及防护知识及其常识.41 附录三 基础生物化学实验室常用仪器简介附录三 基础生物化学实验室常用仪器简介.46 主要参考书目主要参考书目53 实验一实验一 生化实验基础知识生化实验基础知识 一、目的：一、目的：熟悉生物化学实验的基础知识和规定，了解相关仪器的使用方法。二、实验室规则：二、实验室规则：1、实验课必须提前 5 分钟到实验室，不迟到，不早退。2、应自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，保持室内安静，不得大声谈笑，不允许随便打电话。3、使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约，不要使用过量的药品和试剂。应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂污染。试剂用完后应及时归放到试剂架上，便于别人使用，试剂瓶塞不得乱盖。4、实验台、试剂药品架必须保持整洁，仪器药品摆放井然有序。实验完毕，需将药品、试剂排列整齐，仪器洗净倒置放好，实验台面抹拭干净，经教师验收仪器后，方可离开实验室。5、使用和洗涤仪器时，应小心谨慎，防止损坏仪器。使用精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障应立即报告教师，不要自己动手检修。6、使用洗液时不得滴到桌面和地面上，要将洗涤仪器放在搪瓷盆内进行。7、注意安全。实验室内严禁吸烟。煤气灯应随用随关，必须严格做到：火在人在，人走火灭。不能直接加热乙醇、丙酮、乙醚等易燃品，需要时要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即关好煤气阀门和水龙头，拉下电闸。离开实验室以前，应认真负责地进行检查，严防不安全事故的发生。8、在实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。实验完成后经教师检查同意，方可离开。课后写出实验报告，由课代表收齐交给教师。9、废弃液体（强酸、强碱溶液必须先用水稀释）可倒入水槽内，同时用水冲走。废纸、火柴头及其他固体废弃物和带有渣滓沉淀的废弃物都应倒人废品缸内，不能倒入水槽或到处乱扔。10、仪器损坏时，应如实向教师报告，认真填写损坏仪器登记表，然后补偿一定金额。11、实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。12、每次实验课安排同学轮流值日，值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。1 三、实验记录及实验报告：三、实验记录及实验报告：1、实验记录 实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、目的、原理、实验内容、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本上。实验记录本应标上页数，不要撕去任何一页，更不要擦抹及涂改，写错时可以划去重写。记录时必须使用钢笔或圆珠笔，不得使用铅笔。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时地直接记在记录本上，绝对不可以用单片纸做记录或草稿。原始记录必须准确、简练、详尽、清楚。从实验课开始就应养成这种良好的习惯。对实验的每个结果都应正确、无遗漏地做好记录。实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、相对分子质量、准确的浓度等，都应记录清楚，以便在总结实验时进行核对，并作为查找成败原因的参考依据。如果对记录的结果有怀疑、遗漏或丢失等，都必须重做实验。将不可靠的结果当作正确的记录，在实际工作中可能造成难以估计的损失。因此，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。2、实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。在写实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法(或步骤)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。某些实验的操作方法可以和结果与讨论部分合并，自行设计各种表格综合书写。结果与讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。四、相关仪器的使用方法（见附录三）四、相关仪器的使用方法（见附录三）2 实验二实验二 总氮量的测定凯氏（总氮量的测定凯氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法 一、目的：一、目的：1、学习微量凯氏定氮法的原理和方法。2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术。二、原理：二、原理：生物材料中含有许多含氮有机物，如蛋白质，核酸，氨基酸等，故含氮量的测定在生化研究中十分重要。知道了含氮量，就可推知蛋白质含量。有机物与浓硫酸共热，有机氮转变为无机氮（氨），氨与硫酸作用成硫酸铵，后者与强碱作用释放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液中和的程度，即可计算出样品的含氮量，以甘氨酸为例，反应式如下：NH2CH3COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH3NH3+H2SO4（NH4）2SO4（NH4）2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O NH3+HClNH4Cl 用硼酸作为氨的吸收溶液，结果使溶液中H+降低，混合指示剂（pH4.35.4），由黑紫色变为绿色。再用标准酸来滴定，使硼酸恢复到原来的氢离子浓度为止，指示剂出现淡紫色为终点，此时所耗的盐酸量即为氨的量。2NH3+4H3BO3（NH4）2B4O7 +5H2O（NH4）2B4O7 +2HCl+5H2O2NH4Cl+4 H3BO3为了加速消化，可加入CuSO4作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高溶液的沸点。三、实验器材：三、实验器材：KDNO84B定氮仪、消化架、量筒、酸式滴定管、锥形瓶、玻璃珠。四、实验试剂：四、实验试剂：样品：奶粉。浓硫酸（A.R.）。2硼酸溶液:2g 硼酸溶于蒸馏水，稀释至 100mL。40氢氮化钠:40gNaOH 溶于蒸馏水，稀释至 100mL。催化剂：硒粉。指示剂：0.1甲基红0.5溴甲酚绿（1：1）。0.1 mol/L 标准盐酸溶液。3 五、操作步骤：五、操作步骤：1、消化：取两个消化管编号，一只加 1g糖作为空白对照，另一只加 1g样品。然后加少量硒粉及浓硫酸 10mL。置通风橱内的消化架或电炉上加热消化。开始时应控制火力，勿使瓶内液体冲至瓶颈（电压调至 180V200V）。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解释放出SO2白烟后，适当加强火力，直至消化液透明并呈淡绿色为止，冷却，准备蒸馏。2、蒸馏：分别用橡皮管与各进出水接口连接，出水口和排水口用橡皮管连接后置于水池内。冷却水接口与自来水龙头连接，H2O、NaOH输入接口与橡胶管连接后分别置于蒸馏水、氢氧化钠盛器桶内，并关闭排水开关阀门。（a）打开电源开关，水开关，蒸馏水即自动进入发生炉内，达到一定液位高度，受液位控制器控制停止进水，进入电加热状态。（b）在 250mL 三角锥形瓶中加入 2硼酸 50mL，23 滴指示剂，将该瓶套在接收管上，并让管口浸没在硼酸溶液中。（c）取消化冷却后的消化试管置入适量水后，扳动整流消化管托盘架，使消化管固定在蒸馏器托盘架上，开启 NaOH 开关，注入 50mL 氢氧化钠溶液。（d）整齐发生炉内蒸馏水经 12 分钟加热后，开始沸腾，迅速产生蒸汽进入消化管内进行蒸馏，待接收瓶液面高于 150mL 时，将接收瓶下移，使接收管离开液面，用水冲洗出气口，然后取下接收瓶，待滴定之用。4、滴定：用 0.1mol/L HCl 溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至呈浅葡萄紫色，记录所耗 HCl溶液量。5、计算：0()14.0081000VVNAW=样品蛋白质含量（）式中：V 滴定样品用去的 HCl 液毫升数（mL）V0 滴定空白用去的HCl液毫升数（mL）NHCl 的当量浓度（mol/L）14.008每摩尔 N 原子的质量（g）A固定系数（6.25）W试样质量（g）4 实验三 Folin-酚法测定蛋白质含量 实验三 Folin-酚法测定蛋白质含量 一、目的：一、目的：掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。二、原理：二、原理：Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5100g 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。三、实验器材：三、实验器材：鸡蛋、752 型分光光度计、试管、吸管。四、实验试剂：四、实验试剂：（1）Folin-酚试剂A：将1g Na2CO3溶于50mL 0.1mol/L NaOH 溶液。另将0.5g CuSO4 5H2O溶于100mL 1酒石酸钾钠溶液。将前者50mL于硫酸铜酒石酸钾溶液1mL混合。混合后的溶液一日内有效。（2）Folin-酚试剂B：将100g 钨酸钠（Na2WO42H2O）、25 g 钼酸钠（Na2MoO42H2O）、700mL 蒸馏水、50mL 85 磷酸和100mL 浓盐酸置于1500mL磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，以小火回流10h。再加入50g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水2 倍，贮于冰箱中可长期保存。（3）牛血清蛋白溶液：称取0.05g牛血清蛋白溶于0.9NaCl溶液中。（4）样品溶液：称取0.05g鸡蛋清溶于0.9NaCl溶液中。五、操作步骤：五、操作步骤：1、标准曲线的制作 将7 支普通试管编号，按表31顺序加入试剂。混匀，室温放置10min，再各加0.5mL试剂B，30min后，比色（500nm），做吸光度蛋白质浓度曲线。5 表3-1 Folin-酚法测定蛋白质浓度标准曲线制作 表3-1 Folin-酚法测定蛋白质浓度标准曲线制作 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白（mL）0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水（mL）0.5 0.45 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Folin-酚试剂A 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2、样液测定 准确吸取样液0.5mL置于试管内，加入4 mL Folin-酚试剂A，10min后，再加试剂B 0.5 mL 30min后比色（500nm），对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。6 实验四实验四 甲醛法滴定法测定氨基氮甲醛法滴定法测定氨基氮 一、目的：一、目的：连接并掌握甲醛滴定法的原理和方法。二、原理：二、原理：水溶液中的氨基酸位两性离子，不能直接用碱滴定氨基酸的残基。用甲醛处理氨基酸，甲醛于氨结合，形成NHCH2OH，N（CH2OH）2等羟甲基衍生物，NH3上的H游离出来，这样就可用碱滴定NH3放出的H，测出氨基酸的含量。如样品中只含某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果即可算出该氨基酸的量，如样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解液），则滴定结果不能作氨基酸的定量依据。此外，脯氨酸与甲醛作用后，生成不稳定化合物，致使滴定结果偏低；酪氨酸的酚基结构，又可使滴定结果偏高。甲醛滴定法常用以测定蛋白质水解程度，随着水解程度的增加，滴定值增加，当水解完全后，滴定值即保持恒定。三、实验器材：三、实验器材：锥形瓶、碱式滴定管、吸管。四、实验试剂：四、实验试剂：0.5酚酞乙醇溶液：称 0.5g 酚酞溶于 100mL 60乙醇。0.05溴麝香草酚蓝溶液：0.05g 溴麝香草酚蓝溶于 100mL 20乙醇溶液。1甘氨酸溶液：1g 甘氨酸溶于 100mL 蒸馏水。标准 0.1mol/L 氢氧化钠溶液：可用 0.1mol/L 标准盐酸溶液标定。中性甲醛溶液：甲醛溶液 50mL，加 0.5酚酞指示剂约 3mL，滴加 0.1mol/L NaOH 溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。五、操作步骤：五、操作步骤：将 3 只 100mL 锥形瓶标以 1、2、3 号。于 1、2 号瓶内各加甘氨酸（或样品）2.0mL 及蒸馏水 5mL；于 3 号瓶内加蒸馏水 7.0mL。向 3 只锥形瓶中各加中性甲醛溶液 5.0mL，0.05溴麝香草酚蓝溶液 2 滴及 0.5酚酞乙醇溶液 4 滴。然后用标准 0.1mol/L 氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH 8.79.0）。7 10()1.40082VVm=式中：m 1mL 氨基酸溶液中含氨基氮的质量（mg）V1 滴定样品消耗NaOH溶液的体积（mL）V0 滴定空白消耗NaOH溶液的体积（mL）1.4008每毫升 0.1mol/L NaOH 溶液相当的氮质量（mL/mg）8 实验五 氨基酸的分离鉴定纸层析法实验五 氨基酸的分离鉴定纸层析法 一、目的：一、目的：了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。二、原理：二、原理：用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称为上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用f值来表示：fR=展层斑点中心与原点之间的距离溶剂前沿与原点之间的距离 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，f值是常数，故可根据f值作定性依据。样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的f值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动 90，再用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向纸法。氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。三、实验器材：三、实验器材：层析缸、毛细管、层析滤纸、电吹风、针、线、尺、铅笔。四、实验试剂：四、实验试剂：标准氨基酸溶液（1mg/mL）及氨基酸混合液。展层剂：正丁醇80甲酸水=1532。显色贮备液：0.4 mol/L 茚三酮-异丙醇甲酸水=2015（V/V）。五、操作步骤：五、操作步骤：1、滤纸准备：选用新华 1 号滤纸，裁成 1815cm 长方形，在距纸一端 2cm 处划一基线，在线上每隔 2cm，画一小点作点样的原点，见图。9 点样处 18 cm 15 cm 2 cm 天冬氨酸 丙氨酸混和 氨基酸 组氨酸 亮氨酸 图 氨基酸的单向上行层析 2、点样：氨基酸点样量以每种氨基酸含 520L 为宜，用微量注射器或微量吸管，吸取氨基酸样品 10L 点于原点（分批点完），点子直径不能超过 0.5cm，边点边用电吹风吹干。3、展层和显色：将点好样的滤纸两边缘对齐，用白线缝好，制成圆筒，注意缝线处的滤纸两边不能接触，以免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动太快而造成溶剂前沿不齐。将圆筒状滤纸放入平皿中，注意滤纸勿与皿壁接触。把展层剂倒入平皿内，同时加入显色贮备液（每 10mL展层剂加 0.10.5mL的显色贮备液）进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿 1cm时，取出滤纸，作好前沿位置标记后吹干，层析斑点即显蓝紫色。用铅笔轻轻描出各显色斑点的形状，用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值，将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。六、思考题 六、思考题 1、Rf 怎么计算？10 实验六 离子交换柱层析法分离氨基酸实验六 离子交换柱层析法分离氨基酸 一、目的：一、目的：通过实验学会装柱、洗脱、收集等离子交换柱层析技术 二、原理：二、原理：树脂（惰性支持物）上结合了 阳离子或阴离子后，可于阴离子或阳离子结合。改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离，由于不同的 氨基酸在不同的pH值及离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱工程中按先后顺序洗出，达到分离的目的。三、实验器材：三、实验器材：层析柱1.2 cm19 cm。恒流泵。分部收集器。刻度试管 10mL。烧杯 250mL。吸管。四、实验试剂：四、实验试剂：732 型阳离子树脂。氨基酸样品：0.05mol/L 的 Asp 和 Lys（用 0.02mol/L 盐酸配制）。柠檬酸缓冲液（洗脱液，0.45mol/L，PH=5.3）：取柠檬酸（C6O7H8H2O）57 克，用适量蒸馏水溶解，加入氢氧化钠 37.2 克和浓盐酸 21 毫升，混匀，用蒸馏水至定容 2000 毫升。显色剂（0.5茚三酮）：0.5g 茚三酮溶于 100mL 95乙醇中。0.1CuSO4溶液。五、操作步骤：五、操作步骤：1、树脂的处理 干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用 4 倍体积的 2 mol/LHCl 及 2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸 2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用 1mol/L NaOH 浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。2、装柱 垂直装好层析柱，关闭出口，加入柠檬酸缓冲液约 1cm 高。将处理好的树脂 1218mL11 加等体积缓冲液，搅匀，沿管内壁缓慢加入，柱底沉积约 1cm 高时，缓慢打开出口，继续加入树脂直至树脂沉积达 8cm 高。装柱要求连续、均匀、无气泡、表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱 3、平衡 将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出口与层析柱入口相连，树脂表面保留 34cm 左右的液层，开动恒流泵，以 24mL/h 的流速平衡，直至流出液 pH 与洗脱液 pH 相同（约需 23倍柱床体积）4、加样 揭去层析柱上口盖子，待柱内液体流至树脂表面 1.02.0 mm 关闭出口，沿管壁四周小心加入 0.5mL 样品，慢慢打开出口，使液面降至与树脂表面相平处关闭，吸少量缓冲液冲洗柱内壁数次，加缓冲液至液层 34cm 左右，接上恒流泵。加样时应避免冲破树脂表面，避免将样品全部加在某一局限部位。5、洗脱 以柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱流速为 24mL/h，用部分收集器收集洗脱液，4mL/管20 6、测定：分别取各管洗脱液 1mL，各加入显色剂 1mL，混合后沸水浴 5min,冷却，各加 0.1 CuSO4溶液，3mL，混匀，测A570nm。以吸光度值为纵坐标，洗脱液累计体积（每管 4mL，故 4mL为一个单位）为横坐标绘制洗脱曲线。12 实验七实验七 血清蛋白醋酸纤维膜电泳血清蛋白醋酸纤维膜电泳 一、目的：一、目的：1、了解电泳分离蛋白质的一般原理。2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质技术。二、原理：二、原理：蛋白质是两性电解质。在 PH 小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动。在 PH 大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在不同 PH 的溶液中所带电荷不同；因此在电场中移动的速度不同，故可利用电泳法将它们分离出来。醋酸纤维薄膜渗透性强，分离清晰，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物具有用样量少，分离效果好，无吸咐作用，应用广和快速简便的优点。目前已被广泛用在对血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。三、实验器材：三、实验器材：醋酸纤维薄膜、滤纸、电泳仪、恒温水浴箱、小镊子（无齿）、烧杯、量筒、玻璃片（10厘米?3 厘米）、载玻片。四、实验试剂：四、实验试剂：1、PH=8.6 巴比妥缓冲液 称巴比妥钠 10.3 克，巴比妥 1.84 克，溶于蒸馏水加热、搅拌，冷却后稀释至 1000mL。2、染色液 称取偶氮胭脂红 B 0.75g，加甲醇 50mL，醋酸 10mL，蒸馏水 40mL，混匀。3、漂洗液 I（3醋酸甲醇溶液）：取冰醋酸 3mL，加甲醇至 100mL。4、漂洗液 II（3醋酸溶液）：取冰醋酸 3mL，加蒸馏水至 100mL。5、0.4mol/L NaOH 溶液。6、血清（人或兔）。五、操作步骤：五、操作步骤：1、将缓冲液加入电泳槽内，调整槽脚旋使两槽缓冲液处于同一水平面。2、将醋酸纤维薄膜剪成 8cm?2cm 的条状，在膜的粗糙面（无光泽面）一端约 2cm 处用铅笔划一条直线，然后将膜浸入巴比妥缓冲液中，浸泡 20 分钟，取出夹在滤纸中吸去多余的缓冲液。13 3、用盖玻片（最好切去 1/3 的宽度）醮血清少许，然后垂直向下轻轻按在点样线上，加样力求均匀（可先在普通滤纸上练习点样几次），要求在膜条上点上细条状的血清样品。4、将薄膜条平悬于电泳槽的样品支架为防止薄膜表面水分蒸发，粗糙面应向下，膜条两端与浸在缓冲液中的滤纸桥相贴（不含气泡）。点样端放在电泳槽的负极端。盖上电泳槽盖，静置平衡 5min。5、接通电源，调节电压至 150 伏，电流强度 0.40.8 毫安/厘米膜宽，电泳时间约 4050 分钟。（通电时，不许打开槽盖接触缓冲液，以免触电。）6、电泳完毕，切断电源。取出膜条，置于染色液中，染色 10 分钟，再移至漂洗液 I 中泡 5 分钟，然后用漂洗液 II 漂洗数次，使之脱色至背景为止。最后在清水中洗一次，此时可见五条色带。7、若作定量分析，则将薄膜水分吸干后按次序剪下各条色带，及一空白带，分别浸入盛有 0.4mol/L NaOH 溶液的试管中，然后用绿色滤光板比色读 OD 数。由此测及读数，按下法计算各部分蛋白质的百分比（）。2100%ODT=清蛋白清蛋白 11100%ODT球蛋白球蛋白 2、球蛋白的百分比计算依次类推。注：T为各管光密度值总和（T=清OD?2+1OD+2OD+OD+OD）表 7-1 人血清中 5 种蛋白质的等电点及分子量 表 7-1 人血清中 5 种蛋白质的等电点及分子量 等电点（pI）分子量（M）血清清蛋白质 4.88 69,000 1球蛋白 5.06 200,000 2球蛋白 5.06 300,000 球蛋白 5.12 90,000150,000 球蛋白 6.857.50 156,000300,000 14 实验八 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法鉴定胰岛素 实验八 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法鉴定胰岛素 一、目的：一、目的：通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，了解并掌握垂直平板点泳的使用方法。二、原理：二、原理：1、电泳 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。2、影响电泳的主要因素 若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下：1FEq=引（）式中E为电场强度，单位为“V/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻相对抗。故上述现象不会发生。根据Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：6 2Fr v=阻（）式中F阻是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此，6 3Eqr v=（）将（3）式整理得：46E qVr=（）由此可以看出，粒子移动的速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电荷量（q）成正比，而与粒子的大小（r）和溶液的粘度（）成反比。非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。既然在一定pH 条件下，每一分子都具有特殊的电荷（种类与数量）、大小和形状，在一定的时间内它在相同的电场中便应集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析、鉴定的基本原理。15 由于带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不同。为了便于比较，常用迁移率（或称泳动度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率（泳动度）的定义为“带电粒子在单位电场强度下的泳动速度”，若以m表示迁移率，则有：5vmE=（）将（4）式代入（5）式，得6 66E qqrmEr =（）由（6）式可以看出，迁移率（泳动度）仅与球形粒子所带电荷的数量，粒子大小及溶液粘度有关，而与电场强度无关。由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度a 随溶液pH 变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率u 为迁移率m 和当时条件下电离度a 的乘积。即：7um a=（）将（6）式代入（7）式，得：a 86qur=（）由（8）式可以看出，凡能影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量q 及解离度a 的因素如pH 的改变，都会对有效迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH 的缓冲液。同时，所选用的pH 以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。以上讨论的基本上是在溶液中进行的自由电泳的情况。在支持介质中进行的各种电泳，除以上因素影响外，有效迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.020.2 之间。在稀溶液中，离子强度可用下式计算：21()92ImiZi=（）（9）式中，mi为离子的克分子浓度，Zi为离子的价数。3、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,NMethylenaBisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免16 接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵（NH4）2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N,N-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺适合作区带电泳的支持介质。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100mL 凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见表8-1）。表8-1 凝胶浓度选用表 表8-1 凝胶浓度选用表 物质 分子量范围 适用的凝胶浓度（）1042030 110441041520 410411051015 11055105510 蛋白质 510525 104 1520 104105 510 核酸 1052106 22.6 17 4、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3 的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7 的Tris-HCl 缓冲液。而分离胶为pH8.9 的TrisHCl 缓冲液。（3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。下面以蛋白质为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：由于两层凝胶孔径不同，蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离蛋白区带变窄，浓度升高。在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是TrisHCl 缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl 是强电解质，不管在哪层胶中，HCl 几乎都全部电离，Cl布满整个胶板。待分离的蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3 和Tris甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7 条件下解离度仅有0.11的甘氨酸（pI=6.0）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7 条件下带有负电荷的蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I 和电导率S 之间有如下关系：IVS=所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干18 条离得很近但又不同的“起跑线”。当蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH 从6.7 变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，蛋白在一个均一的电位梯度和pH 条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。垂直平板电泳还具有以下优点：一系列样品能在同一块凝胶上进行电泳，显色条件也相同。平板表面大，有利于凝胶的冷却。易于进行光密度扫描测定。垂直平板电泳可用于分析、制备和鉴定蛋白质、核酸等样品。三、实验器材：三、实验器材：（1）垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）（2）稳压稳流直流电泳仪（3）微量注射器（50L）（4）量筒（5）烧杯（6）移液抢（7）染色与脱色缸 四、实验试剂：四、实验试剂：1、1.5琼脂：1.5g 琼脂，100mL pH8.9 分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。2、丙烯酰胺（Acr）3、N，N，N,N-四甲基乙二胺（TEMED）4、N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）5、过硫酸铵（NH4）2S2O3（Ap）6、分离胶缓冲液，pH 8.9（pH 8.9 TrisHCl 缓冲液）：取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。7、浓缩胶缓冲液，pH 6.7（pH 6.7 TrisHCl 缓冲液）：取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100 mL。8、电极缓冲液，pH 8.3（pH 8.3 Tris甘氨酸缓冲液）：Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于无离子水后定容至1 000 mL，用时稀释10 倍。9、7乙酸溶液：19.4 mL 36乙酸稀释至100 mL。19 10、0.05溴酚蓝溶液0.05 g 溴酚蓝溶于100 mL 无离子水中。11、20甘油。12、1mol/L HCl。13、标准胰岛素、胰岛素样品。14、0.05氨基黑10B溶液（染色液）：称取50mg溶于100mL水中。五、操作步骤：五、操作步骤：1、电泳槽的安装 垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电 泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm，形成一个“胶室”，胶就在这两板之间 的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个 槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9 缓冲液配制的1.5琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。2、凝胶的制备（1）分离胶的制备 称取Acr 3.2g，Bis 16mg，过硫酸铵 16mg一起置于50mL烧杯中，然后加入分离胶缓冲液2mL，水14mL，摇匀，使其溶解，随后再加TEMED15L，混匀，将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm 处，立即覆盖23mm 的水层（或水饱和正丁醇），静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。倒掉分离胶上的水层，用小滤纸条吸去表面的水分，注：TEMED 在灌胶前加。（2）浓缩胶的制备 称取Acr 0.12g，Bis 6mg，过硫酸铵 16mg一起置于 50mL烧杯中，然后加入浓缩胶缓冲液 0.4mL，水 2.8mL，摇匀，使其溶解，加TEMED 5L，混匀。立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10 倍的电极缓冲液倒入两槽中