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武装GV1001的重组溶瘤...感病毒构建及抗肿瘤作用研究_李聪.pdf
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1、免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023 论著 文章编号1000-8861(2023)03-0262-08;DOI10.13431/ki.immunol.j.20230034武装GV1001的重组溶瘤流感病毒构建及抗肿瘤作用研究李聪,孙芳,程晋霞,田崇瑜,邓卓雅,于洪妤,田昱莹,牛燕,杨鹏辉*摘要 目的 拯救嵌合GV1001的重组溶瘤流感病毒株,并通过体内外实验全面评价其选择性杀伤肝癌的效果。方法 将编码GV1001肽的碱基序列串联重复3次序列优化设计后插入到A/PuertoRico/8/34(PR8)病毒的NA片
2、段。采用反向遗传学技术,重 组 质 粒 pOV-GV1001-NA 与 pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW197-M、pHW198-NS PR8 7个质粒共同转染COS 1/MDCK细胞,拯救得到重组溶瘤病毒rOV-GV1001-NA。经过血凝实验、TCID50、PCR、透射电镜、细胞免疫荧光等鉴定,流式细胞术检测rOV-GV1001-NA诱导肝癌细胞死亡的方式,进一步通过肝癌H22细胞小鼠皮下荷瘤模型评价rOV-GV1001-NA体内溶瘤效果。结果 重组溶瘤病毒rOV-GV1001-NA血凝效价为29,病毒滴度达5
3、LogTCID50/ml,并可在SPF鸡胚中稳定传代;电镜观察形态大小符合流感病毒特点;细胞免疫荧光证明GV1001成功插入并表达;细胞凋亡实验表明rOV-GV1001-NA可选择性诱导肝癌细胞凋亡;肝癌小鼠皮下荷瘤模型证实rOV-GV1001-NA可显著抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期,且具有剂量依赖性。结论 利用反向遗传学技术成功构建了武装GV1001的重组溶瘤流感病毒,体内外实验表明rOV-GV1001-NA能够靶向杀伤肝癌细胞而对正常细胞无明显影响,该结果将为肿瘤疫苗研究提供新思路,有望为肝癌临床治疗开辟新途径。关键词 溶瘤病毒;肝癌;GV1001;免疫疗法中图分类号 R735.7文献标识
4、码 AConstructionandanti-tumoreffectvalidationofrecombinantoncolytic influenza virus armed with GV1001LI Cong1,2,SUN Fang2,CHENG Jinxia2,TIAN Chongyu2,DENG Zhuoya2,YU Hongyu1,2,TIAN Yuying1,2,NIU Yan1,YANG Penghui1,2,*1.College of Basic Medical Science,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010110,C
5、hina;2.The First MedicalCenter,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China*Corresponding Author:YANG Penghui,E-mail:Abstract Oncolytic virus could selectively kill tumors and induce systemic anti-tumor immune responseshowing broad application prospects in clinic.This study was designed to resc
6、ue the chimeric recombinant oncolyticinfluenza armed with GV1001,and evaluate its effect on selective killing of liver cancer in vitro and in vivo.Thesequence encoding GV1001 peptide was optimized in triple tandem repeats and inserted into the NA fragment of A/PuertoRico/8/34(PR8)virus.Using reverse
7、 genetics technology,the recombinant plasmid pOV-GV1001-NA andthe remaining seven plasmids of the PR8 backbone,containing pHW191-PB2,pHW192-PB1,pHW193-PA,pHW194-HA,pHW195-NP,pHW197-M and pHW198-NS,were co-transfected with COS1/MDCK cells to rescuethe recombinant oncolytic virus rOV-GV1001-NA.Further
8、more,the recombinant oncolytic virus was identified withhemagglutination,TCID50,PCR,transmission electron microscope(TME),cellular immunofluorescence,etc.In vitro,flow cytometry was used to detect the way of rOV-GV1001-NA to induce hepatocellular carcinoma cell death.Furthermore,the oncolytic effect
9、 of rOV-GV1001-NA invivo was evaluated in the subcutaneous H22 tumor-bearing mice model.Data showed that hemagglutinationtiters of recombinant oncolytic virus rOV-GV1001-NAwas 27,and the viral titers reached 5 LogTCID50/ml.rOV-GV1001-NA could stably passage in SPF chicken基金项目:北京市自然科学基金(7202194)作者单位:
10、010110呼和浩特,内蒙古医科大学基础医学院(李 聪,于洪妤,田昱莹,牛 燕,杨鹏辉);100853北京,中国人民解放军总医院第一医学中心(李 聪,孙 芳,程晋霞,田崇瑜,邓卓雅,于洪妤,田昱莹,杨鹏辉)*通信作者:杨鹏辉,E-mail:262免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023肝癌是癌症死亡的最常见原因之一1。其中,中国是肝癌患者数量最多的国家,且肝癌的发病率还在不断上升(每10万人中有18.3例)2。肝癌的预后较差,其死亡率约为8.53。目前,只有5%15%的患者能够接受手术切除4。其他治疗方法包括经动
11、脉 化 疗 栓 塞(transarterial chemoembolization,TACE)、肝动脉输注化疗(hepatic arterial infusionchemotherapy,HAIC)、放疗、化疗和免疫治疗。因此,探索一种更有效的肝癌治疗方法,延长患者的总生存期具有重要意义。溶瘤病毒作为一种免疫疗法,具有不同于传统治疗方法的独特优势。首先,在溶瘤病毒治疗后,会引起肿瘤的特异性畸变5。畸变导致肿瘤细胞无法感知并阻止病毒复制。第二,溶瘤病毒可刺激局部和全身的抗肿瘤免疫反应。在溶瘤病毒给药部位,溶瘤病毒感染肿瘤细胞促使肿瘤细胞裂解死亡;在细胞裂解死亡过程中肿瘤相关抗原会被释放,从而激活
12、树突状细胞,引起全身性的免疫反应。第三,溶瘤病毒可感染和破坏肿瘤血管系统,诱导中性粒细胞流入,导致血管塌陷和肿瘤细胞死亡6。第四,溶瘤病毒经过基因修饰和改造溶瘤作用明显增强。例如,溶瘤病毒可携带GM-CSF、CTLA4、PD-1等外源基因,增强其抗肿瘤作用7-9。目前,已有5种溶瘤病毒药物获准上市,即RIGVIR(2004年,拉脱维亚)、H101(2005 年,中国)、T-VEC(2015 年,美国)、Teserpaturev(2021 年,日本)、Adstiladrin(2022 年,美国)。GV1001是由16个氨基酸组成的肽,来源于人类端粒酶逆转录酶催化亚基的611-626个氨基酸对应的
13、肽段10。由于超过90%的恶性肿瘤通过端粒酶来维持永生,因此GV1001在多种肿瘤细胞中是高表达的。目前的临床试验中,可见使用GV1001肽治疗胰腺癌(NCT02854072)、肝细胞癌(NCT00444782)、非 小 细 胞 肺 癌(NCT01579188)、黑 色 素 瘤(NCT01247623)、良性前列腺增生(NCT04032067)等。研究表明,GV1001可以通过触发CD4+和CD8+T细胞特异性免疫反应来发挥其抗癌潜能11。因此,本研究旨在探索GV1001重组溶瘤病毒在肝癌中的抗肿瘤作用,有望为肝癌临床治疗提供新思路。1材料与方法1.1主要试剂与仪器DMEM基础培养基、胎牛血清
14、购自美国Gibco公司;MinElute Gel Extraction Kit与 Effectene Transfection Reagent 购自德国 QIAGEN公 司;TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix 购自 TransGen 公司;Annexin V-FITC/PIApoptosis Detection Kit购自诺唯赞生物技术有限公司;anti-NP抗体购自美国GeneTex;1%鸡红细胞悬液购自广州鸿泉生物科技有限公司;透射电子显微镜 购 自 荷 兰 Phenom 公 司;Optima L-100 XPUltracentrifu
15、ge 购自美国贝克曼库尔特有限公司;P100 Micro-Volume Spectrophotometer 购 自 美 国Thermo公司。1.2细胞系、病毒、质粒人正常肝细胞L02、人肝癌细胞系LM3和Hep3B购自ATCC(American TypeCulture Collection)细胞库。非洲绿猴肾细胞COS 1细胞和犬肾细胞MDCK购自中国科学院上海生物科学研究院。小鼠肝癌细胞H22由中国人民解放军总医院保存。PR8 流感病毒株,质粒 pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW
16、198-NS 保存于本实验室;感受态大肠杆菌 DH5 购自TianGen公司;pHW2000载体质粒由本实验室提供。1.3实验动物SPF鸡胚订购于勃林格维通;68embryos.Viral morphology and size observed with TME were similar with the characteristics of influenza virus.Meanwhile,the fluorescent images demonstrated successful insertion and functional expression of GV1001.Apoptos
17、is results showed that rOV-GV1001-NA can selectively induce hepatocellular carcinoma cell apoptosis.Inaddition,in homologous allogeneic mouse models,we found that rOV-GV1001-NA could significantly inhibit tumorgrowth and prolong mouse survival in a dose-dependent manner.In conclusion,the recombinant
18、 oncolytic influenzavirus armed with GV1001 has successfully constructed using reverse genetics technology,while in vivo and in vitroexperiments demonstrated that rOV-GV1001-NA could selectively target and kill liver cancer cells without obviouseffect on normal cells,which will provide a new idea fo
19、r cancer vaccines and a novel strategy for cancer treatment.Key words Oncolytic virus;Liver cancer;GV1001;Immunotherapy263免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023周龄雌性Balb/c小鼠从北京维通利华实验动物技术有限公司订购。实验动物的使用与动物实验方案均按照中国人民解放军总医院实验动物伦理委员会批准的指导方针进行。1.4重 组 质 粒 pOV-GV1001-NA 构 建根 据GenBank 和
20、 UniProt 中 登 录 的 hTERT 序 列 获 得GV1001基因组开放阅读框序列,将GV1001序列优化后插入流感病毒PR8骨架质粒NA基因第226位点。载体构建由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。1.5拯救重组溶瘤流感病毒rOV-GV1001-NA将重组质粒pOV-GV1001-NA与PR8其余7个骨架质粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW197-M、pHW198-NS分别稀释至200 ng/l。将COS 1细胞、MDCK细胞接种于6孔板,每孔2105个COS 1细胞、1105个MDCK 细胞,待细胞
21、长至单层,按转染试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)说明书进行转染。转染后的培养板置 37、5%CO2培养箱培养 72 h 后,-80 冰箱冻存。1.6重组溶瘤流感病毒rOV-GV1001-NA的全面鉴定1.6.1红细胞间接凝集试验经过冻融后,取转染的细胞悬液接种9日龄的SPF鸡胚(300 l/枚),同一细胞悬液接种2枚鸡胚,接种完以蜡块密封置培养箱培养。3 d后4 冰箱6 h或过夜处理鸡胚,收集鸡胚尿囊液并用新鲜鸡红细胞进行红细胞间接凝集试验。1.6.2半数组织培养感染剂量测定将MDCK细胞接种于 96 孔细胞板,3104个/孔,细胞密度达到70%80%时,PBS洗涤3次。按
22、10-1、10-2、10-3、10-410-12用 DMEM 对 重 组 溶 瘤 流 感 病 毒 rOV-GV1001-NA 进行倍比稀释,稀释液接种 MDCK 细胞,接种完于37、5%CO2培养箱培养,5 d后观察细胞状态,并用1%鸡红细胞测定血凝效价。1.6.3RT-PCR 鉴定rOV-GV1001-NA 接种鸡胚后收取鸡胚尿囊液,超速离心对病毒进行浓缩,采用Trizol 法提取 rOV-GV1001-NA 的 RNA,反转录为cDNA,PCR扩增NA片段,送生工测序比对。1.6.4电镜观察收集接种重组溶瘤流感病毒rOV-GV1001-NA 的鸡胚尿囊液,4 000 r/min 离心20
23、min去沉渣,32 000 r/min离心2 h留取沉淀,PBS重悬沉淀,悬液经 30%60%蔗糖梯度密度离心,40 000 r/min、4 h、4,吸取病毒区带,32 000 r/min离心2 h留取沉淀,PBS重悬沉淀,负染透射电镜观察病毒形态。1.6.5细胞免疫荧光检测 rOV-GV1001-NA 的表达将MDCK细胞接种于24孔板,4104个/孔,共接种3组:空白对照组、PR8组、rOV-GV1001-NA组,每组做2个重复孔,细胞长至70%80%,分别更换DMEM、PR8稀释液、rOV-GV1001-NA稀释液培养细胞,500 l/孔,PR8与rOV-GV1001以DMEM稀释3 0
24、00倍。病毒感染24 h后,弃培养液,PBS洗涤3次,用4%甲醛固定细胞(4 30 min),PBS洗涤3次,用0.5%Triton X-100(PBS配制)室温透化细胞20 min,5%BSA 室温封闭 30 min,加入 anti-GV1001 抗体、anti-NP抗体(均以PBS配制)4 孵育过夜。滴加荧光二抗,200 l/孔,室温避光孵育1 h,二抗以PBST稀释200倍后使用,滴加DAPI避光染色5 min,激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。固定、透化、封闭、孵一抗操作之间均用 PBS 洗 3 遍,每次 35 min。孵二抗、DAPI染色操作前后以PBST浸洗45遍,每次35 min。
25、1.7体外检测重组溶瘤病毒rOV-GV1001-NA对肿瘤细胞的杀伤作用将L02、Hep 3B、LM3分别接种于 6 孔细胞板,1105个/孔,用 0.1、1、3 MOI 的rOV-GV1001-NA感染L02、Hep 3B、LM3细胞,每个感染复数设置3个复孔,感染48 h时按凋亡试剂盒说明书检测重组溶瘤流感病毒rOV-GV1001-NA诱导细胞凋亡的效果。1.8重组溶瘤流感病毒rOV-GV1001-NA在动物体内的抑瘤效果评价1.8.1肝癌小鼠皮下荷瘤模型构建选择68周龄雌性Balb/c小鼠,腹腔注射5106个H22细胞,1周左右抽取腹水,10 00 r/min离心5 min,弃上清,PB
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