液相色谱-串联质谱法同时测定黄酒中20种多酚含量_胡建刚.pdf
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1、第 14 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.2 2023 年 1 月 Journal of Food Safety and Quality Jan.,2023 基金项目:浙江省市场监督管理局科技项目立项计划项目(20210157)、浙江省市场监管局“雏鹰计划”培育项目(CY2022354)Fund:Supported by the Science and Technology Project Plan of Zhejiang Market Supervision and Administration Bureau(20210157),and the Z
2、hejiang Market Supervision Bureau“Eagle Plan”Cultivation Project(CY2022354)*通信作者:吴坚,硕士,高级工程师,主要研究方向为食品质量与安全。E-mail:*Corresponding author:WU Jian,Master,Senior Engineer,Shaoxing Testing Institute of Food and Drug,No.286,Century East Street,Mashan Town,Shaoxing 312000,China.E-mail: 液相色谱-串联质谱法同时测定黄酒中 2
3、0 种多酚含量 胡建刚1,刘 镇1,周建弟2,何雨欣1,王灵芝1,钱圣楠1,马嘉俊1,吴 坚1*(1.绍兴市食品药品检验研究院,国家黄酒产品质量检验检测中心,绍兴 312000;2.国家黄酒工程技术研究中心,浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司,绍兴 312000)摘摘 要要:目的目的 建立液液萃取-液相色谱-串联质谱法同时测定黄酒中 20 种多酚(没食子酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、槲皮素、香豆酸、原儿茶酸、山奈酚、绿原酸、牡荆素、槲皮苷、金丝桃苷、芦丁、表儿茶素、鞣花酸、肉桂酸、芥子酸)含量的分析方法。方法方法 样品经浓盐酸酸化后用乙酸乙酯、乙醚提取。目标物经 Water
4、s ACQUITY HSS T3 色谱柱(2.1 mm100 mm,1.8 m)分离,电喷雾离子源负离子多反应监测模式采集,以质量数和保留时间定性,峰面积(外标法)定量。结果结果 在 5500 g/L 范围内,20 种多酚的线性关系良好,标准曲线相关系数大于 0.997,方法定量限为 0.47.8 g/L,加标回收率为71.1%111.0%,相对标准偏差为 0.63%9.42%。结论结论 采用该方法对黄酒中的 20 种多酚进行检测,前处理步骤简单,测定快速,准确度和灵敏度高。关键词关键词:液相色谱-串联质谱法;多酚;黄酒;液液萃取 Simultaneous determination of 2
5、0 kinds of polyphenols in Chinese rice wine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry HU Jian-Gang1,LIU Zhen1,ZHOU Jian-Di2,HE Yu-Xin1,WANG Ling-Zhi1,QIAN Sheng-Nan1,MA Jia-Jun1,WU Jian1*(1.Shaoxing Testing Institute of Food and Drug,National Center for Quality Inspection and Testing of Chin
6、ese Rice Wine,Shaoxing 312000,China;2.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine,Zhejiang Guyue Longshan Shaoxing Wine Co.,Ltd.,Shaoxing 312000,China)ABSTRACT:Objective To establish an analytical method for the simultaneous determination of 20 kinds of polyphenols(gallic acid,catechin
7、,vanillic acid,caffeic acid,syringate acid,p-conmaric acid,ferulic acid,quercetin,coumalic acid,protocatechuic acid,kaempferol,chlorogenic acid,vitexin,quercitrin,hyperoside,rutin trihydrate,epicatechin,ellagic acid,cinnamic acid,sinapic acid)in Chinese rice wine by liquid chromatography-tandem mass
8、 spectrometry combined with liquid-liquid extraction.Methods The sample was acidified using concentrated hydrochloric acid,extracted with ethyl acetate and ether.The target compounds were separated by Waters ACQUITY HSS T3 chromatography column(2.1 mm100 mm,1.8 m).The mass spectrometer data were acq
9、uired under DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.02.056218 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 multiple reaction monitoring of the electrospray ionization source negative ion mode.The qualitative analysis was performed with mass number and retention time,and the peak area(external standard method)was quantifi
10、ed.Results The results showed that the liner of 20 kinds of polyphenols was good in the range of 5500 g/L.The linear correlation coefficients were more than 0.997,and the limits of quantification were 0.47.8 g/L.The recoveries for spiked samples were 71.1%111.0%with the relative standard deviations
11、of 0.63%9.42%.Conclusion The method has the advantages of simple pretreatment steps,rapid determination,high accuracy and sensitivity for detecting 20 kinds of polyphenols in Chinese rice wine.KEY WORDS:liquid chromatography-tandem mass spectrometry;polyphenols;Chinese rice wine;liquid-liquid extrac
12、tion 0 引 言 黄酒历史悠久,它以稻米、黍米、小米、玉米、小麦等谷物和水为主要原料,添加酒曲和部分酶制剂、酵母等糖化发酵剂酿制而成1。黄酒保留了发酵过程中产生的营养和健康活性物质,具有保健、养生功效,被誉为“酒中之祖,液体蛋糕”24。黄酒中除富含多种氨基酸、维生素、低聚糖、矿物质微量元素以外,还含有对人类健康非常重要的功能性营养成分如黄酮、类黄酮、单宁等57,这类分子中具有多个酚羟基化合物,统称为多酚类物质8。多酚类物质有很强的活性氧以及氧自由基的清除能力912,可以抑制和隔断链式自由基的氧化反应,还可以与金属离子螯合,进而降低金属离子对氧化反应的催化作用,对自由基所引起的生物大分子损伤
13、起较强的保护作用1314,具有抗糖尿病1516、抗癌1718、改善肠道功能19等生理作用。黄酒中多酚一方面可以清除机体内自由基,减轻和消除机体内氧化应激,赋予黄酒预防癌症和心血管疾病的功能2021,另一方面可以保持黄酒中部分成分不被氧化,维持酒体的非生物稳定性22。由于其健康功能属性,多酚种类与含量对评价黄酒的营养价值具有重要参考意义,黄酒中多酚的检测也受到越来越多关注。已报道用于黄酒中多酚类物质的检测方法主要有紫外分光光度法23、毛细管电泳-电化学方法24、液相色谱法25等。紫外分光光度法只能测定总多酚的含量,不能对单个多酚化合物进行定性和定量的测定26;毛细管电泳-电化学方法对电活性物质具
14、有很高的灵敏度和选择性,但是目前毛细管电泳仪的进样精度较高效液相色谱法低27;液相色谱法在多酚的检测上有一定的应用,可以通过保留时间结合目标物光谱图进行定性,但是同时分析多种多酚时,结构相近的多酚类物质在液相色谱上分离度较低,且其他杂质易对目标物产生干扰28。黄酒种类繁多、基质复杂,由于糖类、蛋白质、氨基酸、多肽、有机酸、色素、生物胺等化合物的影响,采用传统的液相色谱法检测时存在灵敏度低、分析时间长、色谱峰重叠、基质干扰产生假阳性等问题。质谱检测器能够通过精确质量数及二级碎片等信息对目标化合物进行定性分析29。液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem ma
15、ss spectrometry,LC-MS/MS)结合了液相色谱和质谱的优点,除保留时间外,还可以给出每一个目标组分的特征离子对信息,为定量定性提供可靠依据30。即使目标物在色谱上未完全分离,LC-MS/MS 也可以根据特征离子质量色谱图来进行定性定量分析,可实现多组分的高通量检测,同时具有分析速度快、灵敏度高、定性准确等优点。近年来,LC-MS/MS 已应用于茶饮料、红酒、咖啡等食品中多酚类化合物的分析检测3132,但关于 LC-MS/MS在黄酒多酚检测中的应用却鲜有报道。黄酒的主要原料是米和水,参考稻米中33多酚的种类以及现有文献关于黄酒中多酚的报道2427,本研究选定20 种多酚为目标化
16、合物,采用优化后的液液萃取法提取目标物,应用 LC-MS/MS 技术,采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式同时测定黄酒中 20 种多酚,以期为黄酒中功能性化合物多酚的检测提供有效手段,科学宣传黄酒的营养价值,助力生产企业提升黄酒的健康属性。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 黄酒样品全部为市售产品。标准物质没食子酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、槲皮素、香豆酸、原儿茶酸、山奈酚、绿原酸、牡荆素、槲皮苷、金丝桃苷、芦丁、表儿茶素、鞣花酸、肉桂酸、芥子酸(纯度98.0%,上海安谱实验科技股份有限公司);乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、乙
17、酸乙酯(色谱纯,德国 Merck 公司);乙醚(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司);浓盐酸、氢氧化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。1.2 仪器与设备 ExionLC AD/Triple Quad 5500+QTRAP Ready 液相色谱三重四极杆质谱联用仪(美国 AB SCIEX 公司);Mili-Q 第 2 期 胡建刚,等:液相色谱-串联质谱法同时测定黄酒中 20 种多酚含量 219 Reference 型超纯水机(美国 Millipore 公司);ME204E 型精密电子天平(精度 0.1 mg)、S220 型酸度计(瑞士 Mettler Toledo 公司);MPE 型真空平行
18、浓缩系统(睿科集团厦门股份有限公司);Centrifuge 5920R 高速冷冻离心机(德国Eppendorf 公司);InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm100 mm,2.7 m)、Bond Elut Plexa 固相萃取柱(200 mg,6 mL)安捷伦科技(中国)有限公司;Poly-Sery MAX 固相萃取柱(150 mg,6 mL)、0.22 m 微孔过滤膜(上海安谱实验科技股份有限公司);Oasis HLB 固相萃取柱(200 mg,6 mL)沃特世科技(上海)有限公司;实验用水(超纯水,由 Milli-Q 纯水系统制备);Water
19、s ACQUITY HSS T3色谱柱(2.1 mm100 mm,1.8 m)(美国 Waters 公司)。1.3 实验方法 1.3.1 液液萃取前处理 取酒样 20 mL,用浓盐酸调节 pH 至 2.0,混匀。取 pH 2.0 的酒样 2.0 mL 于 15 mL 的塑料离心管中,加入 10 mL乙酸乙酯振荡萃取,6000 r/min 离心 2 min,取上清液至浓缩瓶中,用 10 mL 乙酸乙酯重复提取一次,下层水相用 20 mL乙醚分两次萃取,合并乙酸乙酯及乙醚萃取液,于 35真空平行浓缩系统旋蒸浓缩至近干,用 10.0 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣,过 0.22 m 滤膜进样。1.3
20、.2 固相萃取前处理 HLB 小柱和 Bond Elute Plexa 小柱预先用 6 mL 甲醇、6 mL 水活化,取已调 pH 2.0 的酒样 2.0 mL 过柱,重力作用自然流下,用 6 mL 水淋洗,弃去淋洗液,10 mL 甲醇洗脱,收集洗脱液,35水浴氮吹浓缩至近干,10.0 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣,过 0.22 m 滤膜进样。MAX 混合型阴离子交换柱预先用 5 mL 甲醇、5 mL水活化,用 1.0 mol/L 氢氧化钠调节酒样 pH 至 7.47.8,取2.0 mL 上样,重力作用下自然流下,用 5 mL 水淋洗,并将液体抽干,5 mL 4%甲酸甲醇洗脱,35水浴氮吹浓
21、缩至近干,10.0 mL 50%乙腈水溶液溶解残渣,过 0.22 m 滤膜进样。1.3.3 标准溶液的配制 标准储备液:准确称取 20 种多酚标准品各 5 mg,分别用乙腈溶解定容至 10 mL,得 500 mg/L 标准储备液,于18避光保存。标准工作溶液:吸取一定量的标准储备液于10 mL容量瓶中,用 50%乙腈定容,逐级稀释配制成质量浓度为 5、10、50、100、250、500 g/L 的混合标准工作溶液。1.3.4 液相色谱条件 色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm100 mm,1.8 m);流动相 A:1%乙酸水;流动相 B:甲醇;流速:0.40 mL/
22、min;进样量:1 L;柱温:40;梯度洗脱程序见表 1。表 1 20 种多酚的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution procedure of 20 kinds of polyphenols 步骤 时间/min 流动相 A/%流动相 B/%1 0.0 95 5 2 0.5 95 5 3 3.0 50 50 4 6.0 5 95 5 8.0 5 95 6 8.1 95 5 7 10.0 95 5 1.3.5 质谱条件 电喷雾离子源;离子源温度 550;电喷雾电压4500 V;检测模式:MRM;气帘气压力:35.0 psi;喷雾器压力50.0 psi;辅助加热器压力:55
23、.0 psi;碰撞气流速:9 mL/min;质谱参数见表 2。表 2 20 种多酚的质谱参数 Table 2 Mass spectrum parameters of 20 kinds of polyphenols 化合物 保留时间/min 母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电压/V 碰撞能量/eV 没食子酸 1.90 169.0 125.0*,107.0 76 21,26 儿茶素 3.43 289.0 245.0*,109.0 120 27,35 香草酸 3.88 167.0 152.0*,108.0 40 20,30 咖啡酸 3.85 179.0 135.0*,107.0 74 23,33
24、 丁香酸 3.96 197.0 182.0*,167.0 60 19,24 对香豆酸 4.22 162.9 119.1*,93.0 77 19,40 阿魏酸 4.29 193.0 134.0*,178.0 61 20,18 槲皮素 5.05 301.0 179.1*,151.0 160 26,29 香豆酸 2.74 138.9 95.0*,51.0 40 14,22 原儿茶酸 3.06 153.0 109.0*,81.0 68 21,29 山奈酚 5.39 285.0 93.0*,159.0 130 48,44 绿原酸 3.58 353.1 191.0*,161.0 67 26,38 220
25、食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 第 14 卷 表 2(续)化合物 保留时间/min 母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电压/V 碰撞能量/eV 牡荆素 4.23 431.0 311.0*,283.0 130 33,48 槲皮苷 4.66 447.0 300.0*,271.0 100 35,63 金丝桃苷 4.42 463.0 300.0*,271.0 100 40,59 芦丁 4.41 609.2 300.0*,270.9 120 54,77 表儿茶素 3.79 289.0 245.0*,109.0 120 27,35 鞣花酸 4.62 301.0 284.0*,300.1 80 4
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