雾化吸入母牛分枝杆菌减轻哮喘小鼠氧化应激水平_方莉婷.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）雾化吸入母牛分枝杆菌减轻哮喘小鼠氧化应激水平*方莉婷，章谦男，肖欢，李超乾（广西医科大学第一附属医院急诊科，南宁530021）摘要目的：研究雾化吸入母牛分枝杆菌（微卡）对卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘小鼠氧化应激水平的影响及其可能的机制。方法：将18只68周Balb/C雄性小鼠随机分为对照组、哮喘组、微卡干预组，每组6只；利用OVA对哮喘组和微卡干预组小鼠致敏和激发建立哮喘模型，微卡干预组在每次激发前予雾化吸入微卡进行干预，对照组予等量生理盐水进行致敏和激发；于末次激发24 h内行肺功能检测；苏木精伊红（HE）染色、过碘酸雪夫（PAS）染色观察肺组织病理改变、气道杯状细胞增生情况；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测肺泡灌洗液（BALF）中白介素（IL）-4、白介素（IL）-13及干扰素（IFN）-水平；检测肺组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及还原型谷胱甘肽（GSH）含量；蛋白免疫印迹实验（western blotting）检测核因子E2相关因子（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）蛋白表达水平；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测Nrf2、HO-1mRNA表达水平。结果：雾化吸入微卡改善哮喘小鼠气道高反应性、肺组织炎症反应及杯状细胞增生（均P0.05），降低BALF中IL-4和IL-13水平（P0.01），促进IFN-分泌（P0.01），上调SOD、GSH水平（均P0.05），减少MDA含量（P0.01），肺组织Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达增加（均P0.05）。结论：雾化吸入微卡可能通过调节Nrf2/HO-1通路减轻OVA诱导哮喘小鼠氧化应激。关键词支气管哮喘；母牛分枝杆菌；氧化应激；Nrf2；HO-1中图分类号：R562.25文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1931-06DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.010Reduction of oxidative stress in asthmatic mice by aerosol inhalation of Mycobacterium vaccaeFang Liting，Zhang Qiannan，Xiao Huan，Li Chaoqian.（Department of Emergency,The First Affiliated Hospitalof Guangxi Medical University,Nanning 530021,China）AbstractObjective:To study the effects of aerosol inhalation of Mycobacterium vaccae(M.v.)on oxidativestress in ovalbumin(OVA)-induced asthmatic mice and its possible mechanism.Methods:Eighteen male Balb/Cmice of 6-8 weeks were randomly divided into normal control(NC)group,asthma(OVA)group and asthma mod-el withM.v.group,with 6 mice in each group.Mice in OVA group and M.v.group were sensitized and challengedwith OVA to establish asthma models.Mice in M.v.group received aerosol inhalation with M.v.before each chal-lenge,while mice in NC group were sensitized and challenged with the same amount of normal saline.Lung func-tion was detected within 24 hours after the last challenge;HE and PAS staining were used to observe the patho-logical changes of lung tissue and goblet cell proliferation in the airway;the levels of interleukin(IL)-4,interleu-kin(IL)-13 and interferon(IFN)-in BALF were detected by ELISA;the contents of malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and reduced glutathione(GSH)in lung tissue were measured;the protein expres-sions of Nrf2 and HO-1 were detected by western blotting and the expression levels of Nrf2 and HO-1 mRNA byreal-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results:Aerosolized inhalation of M.v.improved airway hyperresponsiveness,lung inflammation and goblet cell hyperplasia in asthmatic mice(all P0.05),decreased the levels of IL-4 and IL-13 in BALF(P0.01),promoted the secretion of IFN-(P0.01),up-regulated the levels of SOD and GSH(all P0.05),decreased MDA content(P0.01)as well as increased themRNA and protein expressions of Nrf2 and HO-1 in lung tissue(P0.05).Conclusion:Aerosol inhalation ofM.v.may reduce the oxidative stress in OVA-inducedasthmatic mice by regulating Nrf2/HO-1 pathway.Keywordsbronchial asthma；Mycobacterium vac-cae；oxidative stress；Nrf2；HO-1*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81860005）；广西自然科学基金资助项目（No.2020GXNSFDA238003；No.2019GXNSFAA185037）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-09-05 1931广西医科大学学报2022 Dec；39（12）支气管哮喘是以可逆性气流阻塞和气道高反应性为特征的异质性疾病，Th1/Th2免疫失衡被认为是支气管哮喘的经典致病机制1。近年来，有越来越多的学者认为氧化应激参与哮喘的发病机制，与炎症反应关系密切。氧化应激是指体内氧化与抗氧化水平失衡的一种状态2。临床研究表明，与健康对照者相比，哮喘患者血浆氧化产物累积，并与肺功能降低、气道阻塞程度呈正相关关系，氧化物累积对气道造成直接损伤的同时还会诱导炎症细胞活化，进一步消耗体内抗氧化酶，加剧气道炎症反应3-4。由此可见，氧化应激参与支气管哮喘的发生与发展，并与气道炎症密切相关。在临床广泛应用糖皮质激素治疗哮喘引起患者耐药性增加的情况下，通过研究氧化应激在哮喘中的作用机制有助于增加未来辅助治疗哮喘的新策略。母牛分枝杆菌（微卡）是一种双向免疫调节剂，雾化吸入微卡可以直接作用于气管黏膜表面，调节T细胞增殖分化，激活机体固有免疫系统。本课题组前期研究表明，雾化吸入微卡能调节哮喘小鼠模型中Th1/Th2型细胞因子，减轻气道炎症反应5。本研究主要关注雾化吸入微卡对卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘小鼠氧化应激水平的影响及其可能的机制。1材料与方法1.1实验动物18只68周Balb/C雄性小鼠，体重1825 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK湘2019-0014。于广西医科大学实验动物中心饲养，动物实验通过广西医科大学动物伦理审查委员会批准（No.202110004）。1.2主要试剂与仪器OVA、乙酰甲胆碱（美国Sigma公司）；注射用微卡（22.5 g/支）（安徽龙科马生物制药有限责任公司）；氢氧化铝粉剂（成都科龙化工有限公司）；白介素（IL）-4、白介素（IL）-13、干扰素（IFN）-酶联免疫吸附试剂盒（ELISA）（武汉华美公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（南京建成生物）；核因子E2相关因子（Nrf2）抗体、血红素加氧酶1（HO-1）抗体、GAPDH抗体（美国CST公司）；荧光羊抗兔IgG（H+L）二抗（美国赛默飞公司）；BCA试剂盒（碧云天）；反转录试剂盒（日本Takara公司）；SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物公司）；引物（北京擎科生物公司）。WH-2000超声雾化器（上海医疗器械厂）；无创型动物肺功能仪（美国Buxco公司）等。1.3动物分组及哮喘模型建立将18只Balb/C雄性小鼠随机分为对照组、哮喘组及微卡干预组，每组6只。按需制备致敏混悬液（25 g 级 OVA和1 mg氢氧化铝粉剂溶于200 L生理盐水）并于第1、第8、第15天腹腔注射哮喘组及微卡干预组小鼠，每只0.2 mL。第2228天将已致敏的小鼠置于自制20 cm30 cm20 cm塑料容器中，每日定时予2%激发混悬液（400 mg V级OVA溶于20 mL 生理盐水）雾化激发30 min，微卡干预组在每次激发前2h予微卡（微卡注射液22.5g溶于10mL生理盐水）雾化吸入30 min进行干预。对照组用等量生理盐水进行致敏和激发。1.4肺功能检测各组小鼠末次雾化激发后24 h内进行肺功能检测，采用无创肺功能检测仪予0 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL 浓度的乙酰甲胆碱20 L依次激发各组小鼠，测定小鼠比气道阻力（sRaw）的变化。检测完毕24 h内处死小鼠并取材。1.5肺组织病理形态观察用4%甲醛固定小鼠左肺组织，室温放置24 h后行石蜡包埋、切片，切片厚4 m，脱蜡后行苏木精伊红（HE）染色和过碘酸雪夫（PAS）染色，光镜下观察肺组织病理形态学改变，进行病理半定量分析6-7。支气管和血管周围炎性细胞浸润评分标准：0分：几乎无炎症细胞；1分：少许炎性细胞浸润；2分：较多炎性细胞浸润；3分：大量炎性细胞浸润，部分集合成团；4分：大量炎性细胞浸润聚集成团围绕在气管与血管周围。气道杯状细胞增生程度评分标准：0分：气道内无杯状细胞；1分：杯状细胞占黏膜上皮细胞25%；2分：杯状细胞占黏膜上皮细胞2550%；3分：杯状细胞占黏膜上皮细胞5075%；4分：杯状细胞占黏膜上皮细胞75%。1.6ELISA用无菌PBS对小鼠行支气管肺泡灌洗3次，每次0.5 mL，肺泡灌洗液（BALF）回收率大于80%，离心后取上清转移至新的EP管，置于-80 冰箱待用。取适量BALF进行ELISA，检测IL-4、IL-193213及IFN-的水平，终止反应后用酶标仪测量450 nm光密度（OD）值，结果与标准曲线比较计算BALF中炎症介质水平。1.7氧化应激指标MDA、SOD、GSH水平检测称量适量小鼠右肺组织，用生理盐水制备10%组织匀浆，离心后取上清备用，BCA法测定组织蛋白浓度，按试剂盒说明书测定肺组织 MDA、SOD、GSH 水平。1.8Western blotting法检测Nrf2、HO-1蛋白表达水平称量适量小鼠右肺组织，配制组织裂解工作液，BCA法测蛋白浓度并定量，加入5蛋白上样缓冲液，100 加热10 min使蛋白变性，保存于-80 冰箱。用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至0.22 m PVDF膜，室温封闭1 h，洗膜，将膜与一抗Nrf2（1 800）、HO-1（1 1 000）和GAPDH（1 1 000）孵育过夜；次日TBST洗膜3次，4 避光孵育荧光二抗（1 10 000）1.5 h，用LI-COR Odyssey系统显影，Image J分析条带灰度值。1.9实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测Nrf2、HO-1mRNA表达水平取小鼠右肺组织，离心柱法提取总RNA后测定RNA浓度及A260/A280，由RNA浓度确定反转录总RNA用量，根据反转录试剂盒说明书依次进行去除基因组DNA反应、反转录反应，反转录合成的cDNA保存于-80 冰箱。预先配制SYBR GREEN核酸染料混合液，加入Nrf2、HO-1、-actin引物及cDNA进行扩增，以-actin为内参。Nrf2上游引物：5-GACATGGAGCAAGTT-TGGCAG-3,下游引物：5-TTCTGTCAGTGTG-GCTTCTGG-3，扩增产物长度：120 bp；HO-1上游引物：5-AGGGTCAGGTGTCC-AGAGAA-3,下游引物：5-GTGAGGCCCATACCAGAAGG-3，扩增产物长度：185 bp；-actin上游引物：5-ACTCTTC-CACCTTCGATGCC-3,下游引物：5-TGGGATA-GGGCCTCTCTTGC-3，扩增产物长度：193 bp。扩增反应体系为20 L，经退火、延伸、变性后，用2-CT法计算Nrf2及HO-1mRNA的相对表达量。1.10统计学方法采用SPSS 26.0统计软件分析,数据用均数标准差（x s）表示，各组间计量资料采用单因素方差分析，LSD-t法进行两两比较；等级资料采用秩和检验，统计图绘制采用GraphPad Prism9.0。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1气道高反应性各组小鼠sRaw随乙酰甲胆碱浓度增加而增加，乙酰甲胆碱浓度为 6.25 mg/mL时，各组小鼠 sRaw 比较差异无统计学意义（P0.05），当乙酰甲胆碱激发浓度为 12.5 mg/mL、25 mg/mL 时，哮喘组较对照组 sRaw 增加（均P0.01），微卡干预组小鼠sRaw较对照组升高，但较哮喘组降低（P0.01）。结果表明雾化吸入微卡可减轻哮喘小鼠气道高反应性，见图1。与对照组比较，*P0.01；与哮喘组比较，#P0.01。图 1各组小鼠气道高反应性比较2.2肺组织病理学改变HE染色及PAS染色结果显示，对照组小鼠肺组织气道形态完整，气道平滑肌无增生，黏膜上皮无脱落、水肿，肺泡壁结构完整，无杯状细胞增生、黏性分泌物及炎性细胞浸润。哮喘组气道管壁可见增厚、脱落甚至断裂，支气管与血管周围有成团分布的炎性细胞，肺泡壁水肿、充血，杯状细胞、黏液腺增生明显，管腔中可见黏液分泌增多，部分可见黏液栓。与哮喘组相比，微卡干预组气道管壁增生、水肿程度减轻，气道及血管周围炎症细胞浸润明显减少，上皮细胞排列正常，杯状细胞及管腔内黏液分泌减少，无黏液栓。肺组织炎症浸润及气道杯状细胞增生程度的病理半定量分析显示，微卡干预组炎症评分和杯状细胞增生程度评分均低于哮喘组（P0.05）。结果表明雾化吸入微卡有效减轻了哮喘小鼠肺组织气道炎症及气道杯状细胞增生，见图2、表1。方莉婷，等.雾化吸入母牛分枝杆菌减轻哮喘小鼠氧化应激水平 1933广西医科大学学报2022 Dec；39（12）表 1各组肺组织病理半定量分析分，x s，n=6组别对照组哮喘组微卡干预组n666炎症评分0.000.003.330.82*1.830.75#气道杯状细胞增生程度评分0.000.003.170.75*1.500.55#与对照组比较，*P0.01；与哮喘组比较，#P0.05。2.3BALF中IL-4、IL-13及INF-水平与对照组相比，哮喘组小鼠BALF中IL-4和IL-13的水平增高，IFN-水平降低（均P0.01）。与哮喘组相比，微卡干预组BALF中IL-4和IL-13水平降低，IFN-增高（均P0.01）。结果表明雾化吸入微卡可以降低哮喘小鼠的IL-4、IL-13水平，促进IFN-分泌，见图3。2.4肺组织氧化应激水平与对照组相比，哮喘组小鼠肺组织MDA含量升高，SOD活力及GSH含量降低（均P0.01）。与哮喘组相比，微卡干预组MDA含量减少（P0.01），SOD活力及GSH含量升高（均P0.05）。结果表明雾化吸入微卡可以改善哮喘小鼠肺组织氧化应激水平，见图4。2.5肺组织Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达水平与对照组比较，哮喘组小鼠肺组织Nrf2及HO-1蛋白和mRNA表达升高（均P0.05），经雾化吸入微卡干预后，微卡干预组小鼠肺组织Nrf2及HO-1蛋白和mRNA表达较哮喘组升高（均P0.05）。结果表明雾化吸入微卡可能通过调节Nrf2/HO-1通路改善哮喘小鼠氧化应激水平，见图5。A：对照组；B：哮喘组；C：微卡干预组。图 2各组小鼠肺组织HE及PAS染色（200）A：IL-4水平；B：IL-13水平；C：IFN-水平；与对照组比较，*P0.01；与哮喘组比较，#P0.01。图 3各组小鼠BALF中IL-4、IL-13和IFN-的水平 19343讨论支气管哮喘等慢性气道炎症疾病通常伴随氧化应激水平的失衡，其原因可能是与气道慢性炎性细胞分泌的内源性氧化物增多相关，其次以汽车尾气、香烟、臭氧等为主的外源性氧化物可能触发了肺表面活性物质磷脂和细胞膜的脂质过氧化过程8-9。氧化物的持续累积可以攻击气道上皮细胞膜从而产生MDA，改变蛋白质/DNA、松弛纤维素之间的连接从而改变细胞膜的流动性、通透性和完整性10，应激状态下，机体诱导SOD与GSH等抗氧化酶分泌增多以维持内环境平衡。因此，检测MDA、SOD、GSH等氧化物指标可了解肺气道上皮细胞膜脂质过氧化和细胞受损的严重程度，反映体内抗氧化的速率。Nrf2/HO-1信号通路在慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤等肺部疾病发挥抗炎、抗氧化、调控细胞生理功能等作用11。既往研究表明，Nrf2介导的抗氧化信号通路参与调节哮喘小鼠的氧化应激，Nrf2-/-小鼠肺组织氧化应激显著，呼吸道阻力增加，Th2细胞介导的炎症因子分泌增多12。胞外氧化剂可激活Nrf2及其下游通路HO-1等抗氧化基因，在肺部疾病中HO-1水平升高被认为是一种保护性反应13。本研究发现，与对照组相比，哮喘组小鼠肺组织MDA增高，SOD、GSH降低，BALF中IL-4、IL-13分泌增多，结合肺组织病理结果显示，哮喘组气道壁存在脱落、断裂，气道周围大片炎症细胞浸润，黏液分泌增多，提示OVA作为外源性氧化剂直接作用于小鼠气道黏膜，小鼠气道上皮细胞生理功能受损，同时激活了免疫细胞诱导氧化物生成，进一步加剧氧化应激程度，这与Song等14研究结果相一致。哮喘组小鼠肺组织Nrf2、HO-1 蛋白和mRNA表达较对照组增加，说明OVA诱导了小鼠的氧化应激水平，启动了Nrf2介导的抗氧化保护链，但可能由于慢性气道炎症级联反应持续存在，HO-1及其他抗氧化物的保护作用被抵消。与哮喘组相比，微卡干预组小鼠肺组织Nrf2、HO-1 蛋白和mRNA表达A：MDA；B：SOD；C：GSH；与对照组比较，*P0.01；与哮喘组比较，#P0.05，#P0.01。图 4各组小鼠肺组织MDA、SOD、GSH水平比较A：Western blotting蛋白电泳图；B：各组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较；C：各组Nrf2、HO-1mRNA相对表达量比较；与对照组比较，*P0.05，*P0.01；与哮喘组比较，#P0.05，#P0.01。图 5各组肺组织Nrf2、HO-1 蛋白和mRNA相对表达量比较方莉婷，等.雾化吸入母牛分枝杆菌减轻哮喘小鼠氧化应激水平 1935广西医科大学学报2022 Dec；39（12）增加，上述氧化物/抗氧化物比例失衡改善，BALF中Th1型细胞因子IFN-分泌增多，Th2型细胞因子IL-4、IL-13分泌减少，气道高反应性减轻，肺组织病理结果显示肺组织炎症浸润及气道杯状细胞增生程度减轻，其原因可能是雾化吸入微卡可直接作用于气管黏膜表面，调节T细胞免疫，减轻了气道炎性细胞浸润，从而减少体内自由基来源，同时上调Nrf2转录活性，驱动Nrf2核转移，增加抗氧化酶含量以及HO-1水平，促进气道上皮细胞生理功能的恢复以提高哮喘小鼠抗氧化能力，改善小鼠气道炎症。综上，雾化吸入微卡可能通过调节Nrf2/HO-1信号通路而发挥抗氧化作用。本研究发现雾化吸入微卡通过抗氧化途径减轻氧化应激水平，为进一步探索微卡的作用机制提供了新的方向。但本实验也存在一定局限性，由于条件受限，未使用基因敲除等方法来验证Nrf2/HO-1在哮喘小鼠中的作用；其次，雾化吸入微卡对哮喘小鼠发挥保护作用是否与其他抗炎、抗氧化信号通路存在交联还需要进一步探索。参考文献：1CEVHERTAS L,OGULUR I,MAURER D J,et al.Ad-vances and recent developments in asthma in 2020J.Al-lergy,2020,75(12):3124-3146.2 HYBERTSON B M,GAO B,BOSE S K,et al.Oxidativestress in health and disease:the therapeutic potential ofNrf2 activationJ.Mol Aspects Med,2011,32(4-6):234-246.3AMMAR M,BAHLOUL N,AMRI O,et al.Oxidativestress in patients with asthma and its relation to 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