固定化酶及固定化技术.pptx

第五章 固定化酶及固定化技术酶：酶：l在水溶液中不在水溶液中不稳定定l一次性使用一次性使用-难回收，回收，难连续化生化生产l用于医用于医药/化学分析化学分析纯度要求高度要求高l产物的分离物的分离纯化困化困难l。l要求将要求将酶变成不溶性成不溶性l实际上将上将酶限制在一定空限制在一定空间 固定化固定化固定酶具有催化活性固定酶具有催化活性l19161916年，美国科学家发现，年，美国科学家发现，酶和载体结合以后酶和载体结合以后，在水，在水中呈不溶解状态时，中呈不溶解状态时，仍然仍然具有生物催化活性具有生物催化活性。固定化酶可重复使用固定化酶可重复使用操作稳定性操作稳定性 酶在固定化后其活力可以缓慢释放酶在固定化后其活力可以缓慢释放,酶的稳定酶的稳定性比天然状态高性比天然状态高,可重复多次使用可重复多次使用.l结果如图所示:固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15%,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性例:将0.5g DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶与10mL 1%壳聚糖溶液在60下连续反应10 次每次反应时间为6h 每次反应后分别测定酶活力一、固定化酶（一、固定化酶（immobilized enzymeimmobilized enzyme）水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体固定化技术固定化技术水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）什么是固定化酶？什么是固定化酶？固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。挥催化作用的酶制剂。酶的固定化技术包括酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋（化学偶联）及包埋等多种方法。等多种方法。与固定化酶技术相配套的是与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器酶生物反应器同一般的化工容器一样，需要对酶反应同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和器温度和pHpH等条件进行严格的控制；不同等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作。的是，酶反应器必须进行无菌操作。酶生物反应器酶生物反应器简简 史史1916年，年，Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性不溶于水而具有活性”1948年，年，Sumner尿素尿素酶制成非溶性制成非溶性酶1953年，年，Grubhofer&Schleith第一次第一次实现了了酶的固定化的固定化1960年，千年，千细一郎，开始了氨基一郎，开始了氨基酰化化酶固定化研究固定化研究1969年，千年，千细一郎成功的将固定化氨基一郎成功的将固定化氨基酰化化酶应用于用于DL-AA的光学分析上的光学分析上1971年，固定化年，固定化酶名称提出，名称提出，Immobilizedenzyme1973年，固定化微生物的年，固定化微生物的应用用固定化大固定化大肠杆菌中的杆菌中的天冬氨酸天冬氨酸酶，由反丁，由反丁烯二酸二酸连续生生产L-天冬氨酸天冬氨酸1976年，固定化酵母年，固定化酵母细胞生胞生产啤酒和酒精啤酒和酒精1978年，日本用固定化年，日本用固定化细胞生胞生产酶固定化枯草杆菌固定化枯草杆菌生生产淀粉淀粉酶1979年，固定化植物年，固定化植物细胞和胞和动物物细胞开始研究胞开始研究1982年，日本首次研究用固定化原生年，日本首次研究用固定化原生质生生产氨基酸氨基酸1986年，郭勇等人固定化原生年，郭勇等人固定化原生质研究研究二、固定化酶的优缺点：二、固定化酶的优缺点：稳定性高；稳定性高；酶可反复使用；酶可反复使用；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；分开；固定化酶的反应条件易于控制固定化酶的反应条件易于控制生产可连续化和自动化，节约劳动力；生产可连续化和自动化，节约劳动力；设备小型化、可节约能源。设备小型化、可节约能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：缺点：缺点：固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化时，酶活力有损失固定化时，酶活力有损失长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜分子底物不适宜与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应助因子的反应三、固定化酶制备三、固定化酶制备l必须注意维持酶的催化活性及专一性。必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化）避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。基本原则：基本原则：l固定化应该有利于生产自动化、连续化。固定化应该有利于生产自动化、连续化。载体能抗一定的机械力。l固定化酶应有最小的空间位阻。固定化酶应有最小的空间位阻。l酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。复使用。l固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。产物或反应液发生化学反应。l固定化酶成本要低，以利于工业使用。固定化酶成本要低，以利于工业使用。酶的固定化方法酶的固定化方法四大类方法：四大类方法：吸附法（包括电吸附法）吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）包埋法（微胶囊法）指通指通过氢键、疏水作用、疏水作用、电子子亲和力等物理作用，和力等物理作用，将将酶吸附到固体吸附吸附到固体吸附剂表面的方法。表面的方法。优点：操作条件温和，固定化点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象分子的构象较少或者不少或者不变化；化；载体廉价易得体廉价易得缺点：缺点：结合力弱，易解吸附合力弱，易解吸附选择载体的原体的原则（1）要有巨大的比表面）要有巨大的比表面积（2）要有活要有活泼的表面的表面（3）便于装柱便于装柱进行行连续反反应。1.1.物理吸附法物理吸附法SMS:一种硅酸盐载体有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶无机载体：氧化铅、皂土、白土、无机载体：氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、高岭土、多孔玻璃、硅藻土、二氧化钛等硅藻土、二氧化钛等2.2.结合法结合法离子键结合法是指通是指通过离子离子键将将酶结合到具有离子交合到具有离子交换基基团的非水溶性的非水溶性载体体上的方法。上的方法。l阴离子交阴离子交换剂：DEAE-纤维素，素，DEAE-葡聚糖凝胶，葡聚糖凝胶，AmberliteIRA-93，410，900；阳离子交阳离子交换剂：CM-纤维素，素，AmberliteCG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。等。l使用注意使用注意：pH、离子、离子强度、温度度、温度l离子离子结合法的合法的操作操作简单，处理条件温和理条件温和，酶的高的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到得到酶活回收率活回收率较高的固定化高的固定化酶。l但是但是载体和体和酶的的结合力比合力比较弱，容易受弱，容易受缓冲液种冲液种类或或pH的影响，在的影响，在离子离子强度高的条件下度高的条件下进行反行反应时，酶往往会从往往会从载体上脱落。体上脱落。l这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。载体结合法中报道最多的方法。l归纳起来有二类：归纳起来有二类：l将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。生偶联反应。l在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。联上去。(与交联法合用）与交联法合用）共价结合法共价结合法酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。价键而固定的方法。l可以形成共价键的基团：可以形成共价键的基团：游离氨基，游离氨基，游离羧基，游离羧基，巯巯基，基，咪唑基，咪唑基，酚基，酚基，羟基，羟基，甲硫基，甲硫基，吲哚基，二吲哚基，二硫键硫键l常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体体首先载体上引进活泼基团首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键关键关键共价键结合法制备固定化酶的“通式”载体活化载体活化活化基团酶分子基团活化基团酶分子基团酶分子和载体连接的功能基团：酶分子和载体连接的功能基团：酶蛋白酶蛋白N-N-端的端的-氨基或赖氨酸残基的氨基氨基或赖氨酸残基的氨基酶蛋白酶蛋白C-C-端的羧基以及端的羧基以及AspAsp残基的残基的-和和-羧基羧基CysCys残基的巯基残基的巯基SerSer、TyrTyr、ThrThr残基的羟基残基的羟基PhePhe、TyrTyr残基的苯环残基的苯环HisHis残基的咪唑基残基的咪唑基TrpTrp残基的吲哚基残基的吲哚基lA A重氮法重氮法lB B叠氮法叠氮法lC C烷基化反应法烷基化反应法lD D硅烷化法硅烷化法lE E溴化氰法溴化氰法载体活化的方法载体活化的方法共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比：l优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。或存在盐类等原因而轻易脱落。l缺点：缺点：l该方法反应条件苛刻，操作复杂；该方法反应条件苛刻，操作复杂；l由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为化酶，酶活回收率一般为3030左右，甚至底物的左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。专一性等酶的性质也会发生变化。l只能用于酶，不能用于微生物的固定化只能用于酶，不能用于微生物的固定化3.3.交联法交联法是指通过双功能试剂，将酶是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法和酶联结成网状结构的方法交联法使用的交联剂是戊二醛、交联法使用的交联剂是戊二醛、己二胺、双偶氮苯等水溶性化合己二胺、双偶氮苯等水溶性化合物。物。戊二醛的两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基酸反应，形成Schiff碱，从而使酶或者菌体蛋白交联，形成固定化酶或固定化菌体。l例：采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂，通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上，在戊二醛浓度1.25%，pH值4.0时固定纤维素酶，该固定化酶的半衰期为60天。用于降解壳聚糖，效果明显。l交交联法反法反应条件比条件比较激烈，固定化的激烈，固定化的酶活回收率一活回收率一般般较低，但是尽可能降低交低，但是尽可能降低交联剂浓度和度和缩短反短反应时间将有利于固定化将有利于固定化酶比活的提高。比活的提高。l单独使用交独使用交联法所得到的固定化法所得到的固定化酶颗粒小、机械性粒小、机械性能差，能差，酶活低，故常与其他方法活低，故常与其他方法联用用酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子酶分子:（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶（b b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶4.4.包埋法包埋法是指将是指将酶或含或含酶微生物包裹在多孔的微生物包裹在多孔的载体中。体中。网格型网格型；微囊型微囊型。网格法网格法将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。微囊型半透膜包埋法（微囊化法）：半透膜包埋法（微囊化法）：将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等l微囊型固定化微囊型固定化酶通常直径通常直径为几微米到几百微米的球几微米到几百微米的球状体，状体，颗粒比网格型要小粒比网格型要小得多，比得多，比较有利于底物和有利于底物和产物物扩散，但是反散，但是反应条件条件要求高，制要求高，制备成本也高。成本也高。微囊发生器微囊发生器酶的固定化模式酶的固定化模式各类固定化方法的特点比较:比较项目比较项目吸附法吸附法结结合法合法 交联法交联法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共价键结合共价键结合离子键结合离子键结合 制备难易制备难易易易难难易易 较难较难较难较难固定化程度固定化程度弱弱强强中等中等 强强强强活力回收率活力回收率较高较高低低高高 中等中等高高载体再生载体再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能费用费用低低高高低低 中等中等低低底物专一性底物专一性不变不变可变可变不变不变 可变可变不变不变适用性适用性酶源多酶源多较广较广广泛广泛 较广较广小分子底小分子底物、药用物、药用酶酶其他固定化酶方法l结晶法：结晶法：l分散法：分散法：l热处理法热处理法l等等等等判断固定化方法的判断固定化方法的优劣及其固定化劣及其固定化酶的的实用性的指用性的指标有有:(1)相相对酶活力活力l具有相同具有相同酶蛋白量的固定化蛋白量的固定化酶与游离与游离酶活力的比活力的比值l通常高于通常高于75%(2)酶的活力回收率的活力回收率l固定化固定化酶的的总活力与用于固定化的活力与用于固定化的酶的活力之百分比称的活力之百分比称为酶的活力的活力回收率。回收率。l一般情况下一般情况下,活力回收率活力回收率应小于小于1,若大于若大于1,可能由于固定化活可能由于固定化活细胞增胞增殖或某些抑制因素排除的殖或某些抑制因素排除的结果果.(3)固定化固定化酶的半衰期的半衰期 衡量操作衡量操作稳定性的关定性的关键.固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题 ：l酶的活性中心的活性中心发生物理化学生物理化学变化化导致致酶活力降低活力降低l酶固定化后多了空固定化后多了空间屏障屏障,增加了增加了传质阻阻力力l酶和和载体体结合不牢固合不牢固,容易脱落容易脱落,酶活力活力损失大失大l固定化固定化颗粒成型困粒成型困难 固定化技术的改进固定化技术的改进l定点固定化技定点固定化技术 l抗体偶抗体偶联、生物素、生物素亲和素和素亲和、氨基酸置和、氨基酸置换（Cys）l多多酶系系统的共固定化的共固定化l多种多种酶同同时固定在膜材料上固定在膜材料上,利用各自的功能利用各自的功能协同催化复同催化复杂的生物的生物转化化过程程l新型的固定化技新型的固定化技术l高分子技高分子技术、纳米技米技术、光、光、辐射等作用射等作用 l加入表面活性加入表面活性剂 l可使可使酶活性大幅度提高，最高的达活性大幅度提高，最高的达100100倍，并增加了倍，并增加了酶使使用次数用次数l等等等等固定化对反应系统的影响l不同制不同制备方法，方法，对酶反反应系系统产生的影响不同生的影响不同l假定：假定：l酶固定化后，在固定化后，在载体表面或多孔介体表面或多孔介质中的分布中的分布完全均完全均质l整个系整个系统各相同性各相同性四、固定化酶性质的变化：四、固定化酶性质的变化：(一）影响固定化酶性能的因素一）影响固定化酶性能的因素l固定化固定化酶制制备物的性物的性质取决于所用的取决于所用的酶及及载体材料的性体材料的性质及相互作用。及相互作用。成分成分参数参数酶酶生物化学性质：生物化学性质：分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数：动力学参数：专一性，专一性，pHpH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pHpH，温度，溶剂，去污剂及杂，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性质的稳定性。载体载体化学特征：化学特征：化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性 机械性质：机械性质：颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。拌罐的磨损。固定固定化酶化酶固定化方法：固定化方法：所结合的蛋白所结合的蛋白,活性酶的产量活性酶的产量,内在的动力学参数内在的动力学参数质量转移效应质量转移效应:分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性稳定性:操作稳定性操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性，贮藏稳定性效能效能:生产力（产品量生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）公斤产品）包括：l酶本身的本身的变化化:主要由于活性中心的氨基酸残基、高主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和构和电荷状荷状态等等发生生变化化;l载体的影响体的影响：在固定化在固定化酶的周的周围，形成了能，形成了能对底物底物产生立体影响的生立体影响的扩散散层以及静以及静电的相互作用等引起的的相互作用等引起的变化。化。l载体与体与酶的相互作用：的相互作用：载体与体与酶的直接作用可能表的直接作用可能表现为活力活力丧失、破坏失、破坏酶结构、封构、封闭酶活性部位等。活性部位等。改变之一：构象改变、立体屏蔽l构象改构象改变：酶分子构象分子构象发生某种扭曲，生某种扭曲，导致致酶与底物与底物结合能力或催化能力下降合能力或催化能力下降l立体屏蔽：立体屏蔽：固定化后，使得固定化后，使得酶的活性中心或的活性中心或调节部位造成某种空部位造成某种空间障碍，使得效障碍，使得效应物或者底物与物或者底物与酶的的临近或者接触受近或者接触受到干到干扰改变之二：分配效应、扩散限制l微微环境：境：微微环境境是指在固定化是指在固定化酶附近附近的局部的局部环境，而把主体溶液境，而把主体溶液称称为宏宏观环境境。l分配效分配效应：由于由于载体性体性质，造成底物和，造成底物和效效应物等在微物等在微观体系和宏体系和宏观体系之体系之间的不等性分配，从的不等性分配，从而影响而影响酶促反促反应速度速度l扩散限制效散限制效应：底物、：底物、产物和效物和效应物等，在物等，在环境中的迁移运境中的迁移运转速度收到限制速度收到限制DEAE 纤维素固定化壳聚糖酶纤维素固定化壳聚糖酶:以以DEAE DEAE 纤维素为载体戊二醛为交联剂纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶固定壳聚糖酶改变之三：微扰l由于由于载体的体的亲水、疏水作用和介水、疏水作用和介质的介的介电常数等性常数等性质,直接影响直接影响酶的催化能力或的催化能力或酶对效效应物作出反物作出反应的能力的能力1.1.固定化后酶活力的变化固定化后酶活力的变化l固定化固定化酶的活力在的活力在多数情况多数情况下比天然下比天然酶小，其小，其专一性也能一性也能发生改生改变。l例如：例如：用用羧甲基甲基纤维素素载体固定的胰蛋白体固定的胰蛋白酶消化不同底物：消化不同底物：酪蛋白（酪蛋白（高分子）原高分子）原酶活力的活力的30%苯苯酞精氨酸精氨酸-对硝基硝基酰替苯胺替苯胺(低分子低分子)原原酶活力的活力的80%。一般认为高分子底物受到一般认为高分子底物受到空间位阻的影响空间位阻的影响比低比低分子底物大。分子底物大。l原因：原因：酶结构的构的变化化空空间位阻位阻l不过，也有个别情况，酶在固定化后反不过，也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。高了酶的稳定性。lMerlose曾曾选择50种固定化种固定化酶，就其，就其稳定性与固定化前的定性与固定化前的酶进行比行比较，发现：l30种种酶稳定性提高，定性提高，l12种种酶无无变化，化，l8种种酶稳定性降低。定性降低。l然而，由于目前尚未找到固定化方法与然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之定性之间规律性，律性，因此要因此要预测怎怎样才能提高才能提高稳定性定性还有一定困有一定困难，但，但大多数情大多数情况下况下酶经过固定化后固定化后稳定性提高了定性提高了。2.2.固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响固定化后酶稳定性提高的原因固定化后酶稳定性提高的原因l可能有以下几点：可能有以下几点：v固定化后固定化后酶分子与分子与载体多点体多点连接，可防止接，可防止酶分子伸展分子伸展变形。形。v酶活力的活力的缓慢慢释放。放。v抑制抑制酶的自降解。将的自降解。将酶与固与固态载体体结合后，合后，由于由于酶失去了分子失去了分子间相互作用的机会，从而抑相互作用的机会，从而抑制了降解制了降解v固定化青霉素固定化青霉素酰化化酶v将将酶于于0.05molL的的PBS（pH7.5）中分）中分别在不同温度下保温在不同温度下保温6小小时，冷却后冷却后测定定酶活力。活力。v固定化固定化酶的的热稳定性定性优于自然于自然酶。固定化酶的稳定性变化固定化酶的稳定性变化1.1.固定化酶；固定化酶；2.2.自然酶自然酶a.a.热稳定性提高热稳定性提高l测试结果测试结果:5:5天后其活性仍可保留天后其活性仍可保留96%.96%.例例:将将DEAE纤维素固定化壳聚糖酶纤维素固定化壳聚糖酶浸泡在浸泡在95%的的乙醇乙醇中，中，连续连续5天测其催化活性天测其催化活性b.b.对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高l提高固定化提高固定化酶对各种有机溶各种有机溶剂的的稳定性，使本来不定性，使本来不能在有机溶能在有机溶剂中中进行的行的酶反反应成成为可能。可能。l提高提高酶对某些抑制某些抑制剂的的稳定性定性l可以可以预计，今后固定化，今后固定化酶在有机合成中在有机合成中应用会用会进一一步步发展。展。c.c.对对pHpH的稳定性提高的稳定性提高l青霉素青霉素酰化化酶在不同在不同pH值的的缓冲液中，于冲液中，于37保温保温16h测定定酶活力。活力。l固定化固定化酶在在pH5.5-10.3活力活力稳定；定；l游离游离酶则仅在在 pH7.0-9.0稳定。定。l固定化固定化酶的的pH稳定性明定性明显优于游离于游离酶。d.d.对蛋白质水解酶的抗性对蛋白质水解酶的抗性固定化后固定化后载体与体与酶的的紧密密连接接对其起一定保其起一定保护作用作用,并并在空在空间上阻碍上阻碍酶与大分子物与大分子物质接近接近,从而降低了从而降低了酶与大与大分子物分子物质结合的几率合的几率,防止防止酶被其他蛋白被其他蛋白酶水解水解.此外：此外：l有些固定化有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。藏，可以提高其活性。大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4下，120天酶活力无变化。对操作稳定性都有影响对操作稳定性都有影响 如图：固定化酶的最适如图：固定化酶的最适温度为温度为60C 60C，而游离酶，而游离酶的最适温度为的最适温度为50C 50C 而固而固定化酶在定化酶在50-65C 50-65C 范围范围内都保持了较高的酶活力内都保持了较高的酶活力,这说明壳聚酶经固定化后这说明壳聚酶经固定化后其在较高温度下的适应范其在较高温度下的适应范围有了明显提高围有了明显提高3.3.固定化酶的最适温度的变化固定化酶的最适温度的变化固定化后，酶的热稳定性提高，固定化后，酶的热稳定性提高，所以固定化酶的最适温度提高所以固定化酶的最适温度提高当然，也有报道最适温度不变或下降的。当然，也有报道最适温度不变或下降的。4.4.最适最适pHpH值的变化值的变化l酶的催化能力的催化能力对外部外部环境特境特别是是pH非常敏感。非常敏感。l酶固定化后，固定化后，对底物作用的最适底物作用的最适pH和和pH-活性活性曲曲线常常常常发生偏移。生偏移。pH对固定化酶的影响l1 1）载体带负电荷，载体带负电荷，pHpH向碱性方向移动。向碱性方向移动。载体带正电荷，载体带正电荷，pHpH向酸性方向移动。向酸性方向移动。（2 2）产物性质对体系）产物性质对体系pHpH的影响的影响l催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pHpH比游离酶的最适比游离酶的最适pHpH值；反之则低值；反之则低l例例:取取0.2gDEAE纤维素固定化壳聚糖素固定化壳聚糖酶与与5mL壳壳聚糖聚糖酶液各液各8份分份分别于不同于不同pH下下测定固定化定固定化酶和游和游离离酶的活力的活力可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH 向酸性偏移向酸性偏移l例：取例：取0.15g固定化黄曲霉固定化黄曲霉毒素解毒毒素解毒酶 和和4ML黄曲霉黄曲霉毒素解毒毒素解毒酶 液各液各8份，分份，分别于不同于不同pH下下测定固定化定固定化酶和游离和游离酶的活力的活力 可见：固定化酶的最适可见：固定化酶的最适pH pH 向碱性偏移向碱性偏移l影响固定化影响固定化酶Km的因素：的因素：1.酶的空的空间立体障碍立体障碍l载体体为电中性中性时，由于，由于扩散限制散限制造成表造成表观Km上升。上升。2.电荷效荷效应l（1）载体与底物体与底物带相同相同电荷，荷，KmKml（2）载体与底物体与底物电荷相反，静荷相反，静电作用，作用，KmKm3.溶液的离子溶液的离子强度度5.5.固定化酶的米氏常数（固定化酶的米氏常数（KmKm）变化）变化 l例：取例：取DEAE纤维素固定素固定化壳聚糖化壳聚糖酶0.2g与与1%壳聚壳聚糖糖酶液液5mL各各6份分份分别加加入入2mL不同不同浓度的度的壳聚糖壳聚糖溶液溶液(0.4%1.5%)于于50C水浴中保温水浴中保温60min测定定还原糖原糖浓度，用双倒数作度，用双倒数作图求得米氏常数求得米氏常数如如图：经线性性拟合可求得合可求得Km(固固)=18.87g/LKm(游游)=2.49g/L五、评价固定化酶的指标l一般一般评价：价：l1 酶活定活定义（IU)：在特定条件下，每一分：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩催化一个微摩尔底物底物转化化为产物的物的酶量定量定义为1个个酶活活单位。位。l2.酶比活定比活定义（游离）：每毫克所具有的（游离）：每毫克所具有的酶活活力力单位位固定化酶l1.固定化固定化酶的比活：每（克）干固定化的比活：每（克）干固定化酶所具有的所具有的酶活力活力单位。位。l或：或：单位面位面积（cm2）的）的酶活力活力单位表示（位表示（酶膜、膜、酶管、管、酶板）。板）。l2.操作半衰期：衡量操作半衰期：衡量稳定性的指定性的指标。l连续测活条件下固定化活条件下固定化酶活力下降活力下降为最初活力最初活力一半所需要的一半所需要的时间（t1/2）3.偶偶联效率以效率以载体体结合合酶量量(或或酶活力活力)的百分数表示：的百分数表示：由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。所以，仍以测定蛋白量较为难确。l4.活力回收酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收率。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力六、固定化细胞六、固定化细胞利用胞内利用胞内酶制作固定化制作固定化酶时，需要破碎，需要破碎细胞，然胞，然后提取后提取酶，这就增加了工序和成本。就增加了工序和成本。科学家科学家设想直接固定含所需胞内想直接固定含所需胞内酶的的细胞胞固定化固定化细胞与固定化胞与固定化酶比比较，其，其优越性越性在于：在于：保持了胞内保持了胞内酶系的原始状系的原始状态与天然与天然环境境，因而更，因而更稳定。定。保持了胞内原有的多保持了胞内原有的多酶系系统，而且无需，而且无需辅酶再生再生。20世世纪70年代，科学家研制成固定化年代，科学家研制成固定化细胞，并且用胞，并且用于生于生产。例如，将酵母菌例如，将酵母菌细胞吸附到多孔塑料的表面上或包胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以用于胞，可以用于酒酒类的的发酵生酵生产固定化增殖固定化增殖细胞胞发酵酵更具有更具有显著著优越性越性 固定化细胞分类、形态特征和生理状态固定化细胞分类、形态特征和生理状态 ：分类方式分类方式固定化细胞类型固定化细胞类型细胞类型细胞类型微生物、植微生物、植 物、动物、动 物物生理状态生理状态死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞形态特征：l固定化固定化细胞由于其用途和制胞由于其用途和制备方法的不同，可以是方法的不同，可以是颗粒粒状、状、块状、条状、薄膜状或不状、条状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相状（与吸附物形状相同）等，同）等，l目前大多数制目前大多数制备成成颗粒状珠体，粒状珠体，这是因是因为：l不不规则形状的固定化形状的固定化细胞易磨胞易磨损，在反，在反应器内尤其是器内尤其是柱反柱反应器内易受器内易受压变形，流速不好，形，流速不好，l圆形珠体由于其表面形珠体由于其表面积最大，与底物接触面最大，与底物接触面较大，所大，所以生以生产效率相效率相对较高。高。l细胞被固定在胞被固定在载体内在形体内在形态学上一般没有明学上一般没有明显的的变化。化。但是，但是，扫描描电镜观察到固定化酵母察到固定化酵母细胞膜有内陷胞膜有内陷现象。象。无无论用海藻酸用海藻酸钙、聚乙、聚乙烯醇或聚丙醇或聚丙烯酰胺凝胶包埋，胺凝胶包埋，都有都有类似情况。形成似情况。形成“凹池凹池”的原因尚待的原因尚待进一步研究。一步研究。l固定化死固定化死细胞：胞：一般在固定化之前或之后一般在固定化之前或之后细胞胞经过物理或化学方法的物理或化学方法的处理，如加理，如加热、匀、匀浆、干燥、干燥、冷冷冻、酸及表面活性、酸及表面活性剂等等处理，目的在于增加理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比，所以比较适于适于单酶催化的反催化的反应。l固定化静止固定化静止细胞胞和和饥饿细胞胞在固定化之后在固定化之后细胞是活胞是活的，但是由于采用了控制措施，的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生胞并不生长繁殖，繁殖，而是而是处于休眠状于休眠状态或或饥饿状状态。l固定化增殖固定化增殖细胞胞又称固定化生又称固定化生长细胞，是将活胞，是将活细胞胞固定在固定在载体上并使其在体上并使其在连续反反应过程中保持旺盛的程中保持旺盛的生生长、繁殖能力的一种固定化方法。、繁殖能力的一种固定化方法。与固定化酶和固定化死细胞比较l固定化增殖固定化增殖细胞能胞能够不断繁殖、更新，反不断繁殖、更新，反应所需的所需的酶也就可以也就可以不断更新，而且反不断更新，而且反应酶处于天然的于天然的环境中，更加境中，更加稳定，因此，定，因此，固定化增殖固定化增殖细胞更适宜于胞更适宜于连续使用。从理使用。从理论上上讲，只要，只要载体不体不解体，不解体，不污染，就可以染，就可以长期使用。固定化期使用。固定化细胞保持了胞保持了细胞原有胞原有的全部的全部酶活性，因此，更适合于活性，因此，更适合于进行多行多酶顺序序连续反反应，所以，所以说，固定化增殖，固定化增殖细胞在胞在发酵工酵工业中最有中最有发展前途。展前途。固定化增殖细胞发酵的优越性固定化增殖细胞发酵的优越性 1 1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体产菌集合体 2 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用3 3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。(膜的膜的选择通透性）选择通透性）4 4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应5 5、抗污染能力强、抗污染能力强固定化细胞技术的局限性：固定化细胞技术的局限性：(1)(1)必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2)(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。他酶的活性止副产物的形成。(3)(3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用,载体形成的孔隙载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性大小影响高分子底物的通透性.(4)(4)如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；的副产物；但这些缺点并不影响它的实用价值。但这些缺点并不影响它的实用价值。固定化酶与细胞的选择依据：l对一个特定的目的和一个特定的目的和过程来程来说，是采用，是采用细胞，胞，还是采用是采用分离后的分离后的酶作催化作催化剂。要。要根据根据过程本身来决定。程本身来决定。l一般一般说:对于一步或两步的于一步或两步的转化化过程用固定化程用固定化酶较合适。合适。对多步多步转换，采用整，采用整细胞胞显然有利。然有利。缺点：缺点：固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降固定化微生物和动植物细胞的应用l固定化微生物固定化微生物细胞：用于生胞：用于生产酒酒类、氨基酸、有机、氨基酸、有机酸、抗生素以及酸、抗生素以及酶和和辅酶，也可以用于有机溶，也可以用于有机溶剂生生产，废水水处理等理等l固定化植物固定化植物细胞：主要用于生胞：主要用于生产人工种子、香精、人工种子、香精、色素、色素、药物、物、酶等等l固定化固定化动物物细胞主要用于生胞主要用于生产疫苗疫苗七、固定化酶的应用七、固定化酶的应用 1 1、在工业上的应用、在工业上的应用用固定化酶可以生产用固定化酶可以生产L-L-氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、半合成的抗生素母核等半合成的抗生素母核等L L氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分DLDL氨氨基酸可连续生产基酸可连续生产L L氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌）氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌）生产生产L LAspAsp：以：以120L120L柱式反应器柱式反应器6060天可生产天可生产5 5吨的吨的L LAspAsp。乙酰乙酰-DL-Ala L-Ala+乙酸乙酸 乙酰乙酰-D Ala （A-D-Ala）Aminoacylase 氨氨 基基 酰酰 化化 酶酶泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化酶用于水解牛奶中的乳糖l牛奶中含有牛奶中含有4 43 3-4-45 5的乳糖，乳的乳糖，乳糖糖酶缺乏症的人缺乏症的人饮用牛奶后将用牛奶后将导致不致不良后果。用乳糖良