PCR及相关技术.pptx

2024/10/7 2024/10/7 周一周一1 1（一）原理（一）原理：建立在建立在建立在建立在DNADNA复制原理基础上的一种技术。复制原理基础上的一种技术。复制原理基础上的一种技术。复制原理基础上的一种技术。2024/10/7 2024/10/7 周一周一2 22024/10/7 2024/10/7 周一周一3 3（二）典型的（二）典型的（二）典型的（二）典型的PCRPCR包括许多循环，每个循环包括三个步骤：包括许多循环，每个循环包括三个步骤：包括许多循环，每个循环包括三个步骤：包括许多循环，每个循环包括三个步骤：（1 1）高温高温高温高温变性模板使之成为单链，变性模板使之成为单链，变性模板使之成为单链，变性模板使之成为单链，9595度约度约度约度约1min1min；（2 2）低温低温低温低温使引物与单链模板退火（复性）使引物与单链模板退火（复性）使引物与单链模板退火（复性）使引物与单链模板退火（复性）5555度左右；度左右；度左右；度左右；（3 3）中温中温中温中温使引物沿模板延伸，使引物沿模板延伸，使引物沿模板延伸，使引物沿模板延伸，7575度左右。度左右。度左右。度左右。经经经经n n次（次（次（次（25-3025-30次）循环后，反应混合物中所含目的次）循环后，反应混合物中所含目的次）循环后，反应混合物中所含目的次）循环后，反应混合物中所含目的DNADNA片段片段片段片段（双链）的拷贝数理论上最高值为（双链）的拷贝数理论上最高值为（双链）的拷贝数理论上最高值为（双链）的拷贝数理论上最高值为2 2n n。但是，在。但是，在。但是，在。但是，在第三轮第三轮第三轮第三轮循环循环循环循环后，才会出现目的后，才会出现目的后，才会出现目的后，才会出现目的DNADNA片段。片段。片段。片段。2024/10/7 2024/10/7 周一周一4 42024/10/7 2024/10/7 周一周一5 5思 考 题l l扩增片断的长度的是如何决定的？l l若以N 表示扩增循环数，当一条双链模板循环扩增30次时，反应体系中总分子数多少？非目的产物多少？目的产物多少？l l若用一条引物能否实现大量扩增？2024/10/7 2024/10/7 周一周一6 6（三）（三）（三）（三）PCRPCR反应体系：反应体系：反应体系：反应体系：反应缓冲液反应缓冲液（10PCR Buffer10PCR Buffer）脱氧核苷三磷酸底物脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmixdNTPmix）耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶，可耐受酶，可耐受9595度左右高温）度左右高温）寡聚核苷酸引物寡聚核苷酸引物（Primer1Primer1，Primer2Primer2，约，约2020个核苷酸，个核苷酸，与目的与目的DNADNA两侧的区域互补）两侧的区域互补）靶序列靶序列（DNADNA模板）五部分组成。模板）五部分组成。2024/10/7 2024/10/7 周一周一7 72024/10/7 2024/10/7 周一周一8 81.1.耐热耐热耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶Taq DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。中分离纯化而得。1)具有具有5-3聚合酶活性和聚合酶活性和5 3核酸外切酶活性核酸外切酶活性2)最适反应温度为最适反应温度为803)最适最适pH8.0和最佳反缓冲液和最佳反缓冲液 TrisHCl 4)最佳二价阳离子最佳二价阳离子Mg2+，其浓度取决于，其浓度取决于dNTP浓度（浓度（2 mM）5)具良好的热稳定性：在具良好的热稳定性：在90下连续反应下连续反应30分钟仍有约分钟仍有约50%的酶活的酶活核苷酸错误掺入的几率比较高核苷酸错误掺入的几率比较高2024/10/7 2024/10/7 周一周一9 9Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性2024/10/7 2024/10/7 周一周一1010Tth DNA 聚合酶的特点：聚合酶的特点：从喜温性真菌中分离获得从喜温性真菌中分离获得1)具有强的具有强的5-3聚合酶活性，缺聚合酶活性，缺3-5核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。2)反应反应pH值为值为9，最适温度为，最适温度为75度。度。3)在在Mn2+存在时，具有很强的反转录酶活性。存在时，具有很强的反转录酶活性。4)当系统同时存在当系统同时存在Mg2+时，反转录产生的时，反转录产生的cDNA在这种酶的作用下还可在这种酶的作用下还可以进行以进行PCR扩增。扩增。故可用于故可用于RT-PCR。2024/10/7 2024/10/7 周一周一1111Pwo DNA聚合酶聚合酶从喜温性古细菌中发现，现在市场销售的从喜温性古细菌中发现，现在市场销售的Pwo DNA聚合酶是在聚合酶是在E.coli中中表达后提取的产物。表达后提取的产物。1)具有强的具有强的5-3聚合酶活性，兼有聚合酶活性，兼有3-5外切酶活性。外切酶活性。2)具有高的耐热性，具有高的耐热性，100度下度下2小时后仍有一半的活性。小时后仍有一半的活性。3)可扩增可扩增5kb的片段，扩增的片段，扩增DNA的准确度比的准确度比Taq DNA聚合酶高约聚合酶高约10倍。倍。4)且其扩增产物为平末端，可直接用于平末端连接。且其扩增产物为平末端，可直接用于平末端连接。C.therm.聚合酶聚合酶1)是一种以是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在度之间。在RT-PCR系统中催化逆转录反应。系统中催化逆转录反应。2)具有具有3-5外切酶活性，合成外切酶活性，合成cDNA准确度比准确度比Tth DNA聚合酶高约聚合酶高约2倍。倍。2024/10/7 2024/10/7 周一周一12122.2.模板：模板：模板：模板：l lPCRPCR扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总扩增的模板通常是从细胞中提取出来的总DNADNA，也可，也可，也可，也可以是以是以是以是mRNAmRNA反转录后形成的反转录后形成的反转录后形成的反转录后形成的cDNAcDNA。l lDNADNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响是一种非常稳定的分子，其作为模板影响是一种非常稳定的分子，其作为模板影响是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCRPCR效果的效果的效果的效果的因素有：因素有：因素有：因素有：1.1.模板的纯度；模板的纯度；模板的纯度；模板的纯度；2.2.模板模板模板模板DNADNA的量；的量；的量；的量；2024/10/7 2024/10/7 周一周一13133.PCR3.PCR引物：引物：引物：引物：PCRPCR引物是与模板引物是与模板引物是与模板引物是与模板DNADNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链，互补的两条人工合成的寡核苷酸链，互补的两条人工合成的寡核苷酸链，互补的两条人工合成的寡核苷酸链，通常由通常由通常由通常由15-3015-30个核苷酸构成。引物与单链个核苷酸构成。引物与单链个核苷酸构成。引物与单链个核苷酸构成。引物与单链DNADNA模板的模板的模板的模板的33端端端端互补且具有游离的互补且具有游离的互补且具有游离的互补且具有游离的33羟基。引物互补于所需扩增羟基。引物互补于所需扩增羟基。引物互补于所需扩增羟基。引物互补于所需扩增DNADNA片段片段片段片段的两端，使的两端，使的两端，使的两端，使DNADNA片段的扩增只限于引物之间的区段。片段的扩增只限于引物之间的区段。片段的扩增只限于引物之间的区段。片段的扩增只限于引物之间的区段。3553-OHHO-2024/10/7 2024/10/7 周一周一1414引物的设计：引物的设计：1.引物长度引物长度：一般：一般20bp左右。左右。2.引物的碱基组成引物的碱基组成：一般：一般G+C占占50-60%，尽量避免数个连续排列的嘌，尽量避免数个连续排列的嘌呤或嘧啶。一对引物之间不能有呤或嘧啶。一对引物之间不能有2个以上的碱基互补，特别是个以上的碱基互补，特别是3端；端；引物本身避免有回文序列。引物本身避免有回文序列。3.酶切位点的设计酶切位点的设计：PCR扩增中，对引物扩增中，对引物5端碱基的要求较低，可在引端碱基的要求较低，可在引物的物的5端加上特殊序列，如限制性酶切位点。端加上特殊序列，如限制性酶切位点。4.复性的温度复性的温度：引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组成、：引物与模板复性温度和所需时间取决于引物的碱基组成、长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际变性温长度、溶液中引物的浓度。复性温度一般低于引物本身的实际变性温度（度（Tm）5度。度。Tm=（G+C）X4（A+T）X2。复性温度通常在。复性温度通常在55-72度之间，提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。度之间，提高复性温度可提高引物与模板结合的特异性。2024/10/7 2024/10/7 周一周一15154.dNTPs4.dNTPs：是是dATP、dCTP、dGTP、dTTP的总称，储存液的总称，储存液pH7.0，浓度一般为，浓度一般为2mM，分装后，分装后20度冻存。典型的度冻存。典型的PCR扩增体系中，扩增体系中，dNTPs的终浓的终浓度为度为20-200uM。5.Mg5.Mg2+2+浓度：浓度：浓度：浓度：Mg2+浓度太低会无浓度太低会无PCR产物，太高会导致非特异产物的合成。通常情产物，太高会导致非特异产物的合成。通常情况下，反应体系中有况下，反应体系中有0.5-2.5mM游离游离Mg2+。6.PCR6.PCR系统中的其他成分：系统中的其他成分：系统中的其他成分：系统中的其他成分：PCR反应缓冲液通常用反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或；明胶或血清白蛋白（血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。）及非离子去污剂等。2024/10/7 2024/10/7 周一周一1616PCR仪仪2024/10/7 2024/10/7 周一周一1717（四）（四）（四）（四）PCRPCR反应技术类型反应技术类型反应技术类型反应技术类型1.1.巢式巢式巢式巢式PCRPCR（nested PCRnested PCR）：）：）：）：设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度，为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度，为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度，为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度，比单一的一对引物比单一的一对引物比单一的一对引物比单一的一对引物PCRPCR扩增灵敏度特异性增加扩增灵敏度特异性增加扩增灵敏度特异性增加扩增灵敏度特异性增加10001000倍。倍。倍。倍。2024/10/7 2024/10/7 周一周一18182024/10/7 2024/10/7 周一周一19192.2.不对称不对称不对称不对称PCRPCR（asymmetric PCRasymmetric PCR）：）：）：）：多用于序列分析。扩增时两引物按多用于序列分析。扩增时两引物按多用于序列分析。扩增时两引物按多用于序列分析。扩增时两引物按50:150:1比例加入反应体系。比例加入反应体系。比例加入反应体系。比例加入反应体系。最终扩增产物大部分是单链最终扩增产物大部分是单链最终扩增产物大部分是单链最终扩增产物大部分是单链DNADNA，可用于对靶序列进行测，可用于对靶序列进行测，可用于对靶序列进行测，可用于对靶序列进行测序。序。序。序。2024/10/7 2024/10/7 周一周一20202024/10/7 2024/10/7 周一周一21213.反转录反转录PCR：是一种从是一种从RNA扩增扩增cDNA拷贝的方法。拷贝的方法。2024/10/7 2024/10/7 周一周一22224.4.定量定量定量定量PCRPCR（quantitative PCRquantitative PCR，Q-PCRQ-PCR）：）：）：）：是应用一种是应用一种是应用一种是应用一种标准作对照标准作对照标准作对照标准作对照，估计出一种特异性靶，估计出一种特异性靶，估计出一种特异性靶，估计出一种特异性靶DNADNA或或或或RNARNA分子相对含量的技术。分子相对含量的技术。分子相对含量的技术。分子相对含量的技术。2024/10/7 2024/10/7 周一周一2323介绍：基于介绍：基于PCR的分子标记技术的分子标记技术2024/10/7 2024/10/7 周一周一2424遗传标记l l遗传标记（遗传标记（Genetic markerGenetic marker）指可识别的等位基因。指可识别的等位基因。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。传标记。l l类型：类型：形态标记（形态标记（morphological markermorphological marker）细胞学标记细胞学标记(cytological marker)(cytological marker)生化标记生化标记(biochemical marker)(biochemical marker)分子标记分子标记(molecular marker)(molecular marker)2024/10/7 2024/10/7 周一周一2525 在遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以在遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以在遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以在遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：下几个条件：下几个条件：下几个条件：（1 1）多态性高；）多态性高；）多态性高；）多态性高；（2 2）表现共显性；）表现共显性；）表现共显性；）表现共显性；（3 3）对农艺性状影响小；）对农艺性状影响小；）对农艺性状影响小；）对农艺性状影响小；（4 4）经济方便，容易观察记载。）经济方便，容易观察记载。）经济方便，容易观察记载。）经济方便，容易观察记载。2024/10/7 2024/10/7 周一周一2626一、形态标记一、形态标记一、形态标记一、形态标记 即外部形态特征。主要包括肉眼可见的外即外部形态特征。主要包括肉眼可见的外即外部形态特征。主要包括肉眼可见的外即外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。一些特性。一些特性。一些特性。形态标记简单直观、经济方便；但数量在形态标记简单直观、经济方便；但数量在形态标记简单直观、经济方便；但数量在形态标记简单直观、经济方便；但数量在多数生物中有限，且多态性较差，表现易受环多数生物中有限，且多态性较差，表现易受环多数生物中有限，且多态性较差，表现易受环多数生物中有限，且多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在遗传育种中过程，周期较长。因此形态标记在遗传育种中过程，周期较长。因此形态标记在遗传育种中过程，周期较长。因此形态标记在遗传育种中的作用是有限的。的作用是有限的。的作用是有限的。的作用是有限的。2024/10/7 2024/10/7 周一周一2727二、细胞学标记二、细胞学标记二、细胞学标记二、细胞学标记 即细胞染色体的变异：包括染色体核型即细胞染色体的变异：包括染色体核型即细胞染色体的变异：包括染色体核型即细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（和带型（和带型（和带型（C C带、带、带、带、N N带、带、带、带、GG带等）的变化。带等）的变化。带等）的变化。带等）的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能与形态标记相比，细胞学标记的优点是能与形态标记相比，细胞学标记的优点是能与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于遗传育种研检测。因此到目前为止，真正应用于遗传育种研检测。因此到目前为止，真正应用于遗传育种研检测。因此到目前为止，真正应用于遗传育种研究中的细胞学标记还很少。究中的细胞学标记还很少。究中的细胞学标记还很少。究中的细胞学标记还很少。2024/10/7 2024/10/7 周一周一2828三、生化标记三、生化标记三、生化标记三、生化标记 主要包括主要包括主要包括主要包括同工酶和等位酶标记同工酶和等位酶标记同工酶和等位酶标记同工酶和等位酶标记。同工酶：同工酶：同工酶：同工酶：指结构不同、功能相似的酶，也即具有指结构不同、功能相似的酶，也即具有指结构不同、功能相似的酶，也即具有指结构不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的酶的不同形式；以上基因座位编码的酶的不同形式；以上基因座位编码的酶的不同形式；以上基因座位编码的酶的不同形式；等位酶：等位酶：等位酶：等位酶：是指由一个基因座的不同等位基因编码是指由一个基因座的不同等位基因编码是指由一个基因座的不同等位基因编码是指由一个基因座的不同等位基因编码的酶的不同分子形式；的酶的不同分子形式；的酶的不同分子形式；的酶的不同分子形式；分析方法：分析方法：分析方法：分析方法：从组织的蛋白粗提物中通过电泳和组从组织的蛋白粗提物中通过电泳和组从组织的蛋白粗提物中通过电泳和组从组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。酶谱带型。酶谱带型。酶谱带型。2024/10/7 2024/10/7 周一周一2929l l与形态标记、细胞学标记相比，生化标记与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具具两个方面的优点：两个方面的优点：一是表现近中性，一是表现近中性，对植物经济性状一般没对植物经济性状一般没有大的不良影响；有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，二是直接反映了基因产物差异，受环境影受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。限制。2024/10/7 2024/10/7 周一周一3030四、分子标记（四、分子标记（DNA标记）标记）在遗传学研究中广泛应用的在遗传学研究中广泛应用的在遗传学研究中广泛应用的在遗传学研究中广泛应用的DNADNA分子标记已分子标记已分子标记已分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为两大类：技术大致可以分为两大类：技术大致可以分为两大类：技术大致可以分为两大类：2024/10/7 2024/10/7 周一周一3131（1 1）以）以）以）以SouthernSouthern杂交技术为核心的分子标记，（如杂交技术为核心的分子标记，（如杂交技术为核心的分子标记，（如杂交技术为核心的分子标记，（如RFLPRFLP），这类分子标记被称为第一代分子标记。），这类分子标记被称为第一代分子标记。），这类分子标记被称为第一代分子标记。），这类分子标记被称为第一代分子标记。（2 2）是以）是以）是以）是以PCRPCR技术为核心的分子标记，（如技术为核心的分子标记，（如技术为核心的分子标记，（如技术为核心的分子标记，（如STSSTS、RAPDRAPD、AFLPAFLP、SSRSSR）等，这类分子标记被称为第二代分子标）等，这类分子标记被称为第二代分子标）等，这类分子标记被称为第二代分子标）等，这类分子标记被称为第二代分子标记；记；记；记；（3 3）单核苷酸多态性（）单核苷酸多态性（）单核苷酸多态性（）单核苷酸多态性（SNPSNP）标记被称为第三代分子标记）标记被称为第三代分子标记）标记被称为第三代分子标记）标记被称为第三代分子标记 。它也是以。它也是以。它也是以。它也是以PCRPCR技术为基础的分子标记技术。技术为基础的分子标记技术。技术为基础的分子标记技术。技术为基础的分子标记技术。2024/10/7 2024/10/7 周一周一3232英文缩英文缩英文缩英文缩写写写写英文名称英文名称英文名称英文名称中文名称中文名称中文名称中文名称RFLPRFLPRestriction fragment length Restriction fragment length polymorphismpolymorphism限制性片段长度多态限制性片段长度多态限制性片段长度多态限制性片段长度多态性性性性STSSTSSequence tagged siteSequence tagged site序列标签位点序列标签位点序列标签位点序列标签位点RAPDRAPDRandom amplified polymor-Random amplified polymor-Phic DNAPhic DNA随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNAAFLPAFLPAmplified fragment lengthAmplified fragment lengthPolymorphismPolymorphism扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性SSRSSRSimple sequence repeatSimple sequence repeat简单序列重复简单序列重复简单序列重复简单序列重复SNPSNPSingle Single nucleotide polymor-nucleotide polymor-phismphism单核苷酸多态性单核苷酸多态性单核苷酸多态性单核苷酸多态性几种主要的分子标记几种主要的分子标记几种主要的分子标记几种主要的分子标记2024/10/7 2024/10/7 周一周一3333几种主要的分子标记几种主要的分子标记（一）（一）RFLP标记：称为限制性片段长度多态标记：称为限制性片段长度多态性，是指用某一种限制性内切酶来切割来性，是指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的自不同个体的DNA分子上，内切酶的识别分子上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上碱序列有差异，即是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。2024/10/7 2024/10/7 周一周一3434RFLPRFLP标记是发展最早的标记是发展最早的标记是发展最早的标记是发展最早的DNADNA标记技术。标记技术。标记技术。标记技术。RFLPRFLP技术主要包括以下基本步骤：技术主要包括以下基本步骤：技术主要包括以下基本步骤：技术主要包括以下基本步骤：DNADNA提取用限制性内切酶酶切提取用限制性内切酶酶切提取用限制性内切酶酶切提取用限制性内切酶酶切DNA DNA、用凝胶电泳分开用凝胶电泳分开用凝胶电泳分开用凝胶电泳分开DNADNA片段把片段把片段把片段把DNADNA片段转片段转片段转片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的示特定的示特定的示特定的DNADNA片段（片段（片段（片段（SouthernSouthern杂交）和结果杂交）和结果杂交）和结果杂交）和结果分析。分析。分析。分析。2024/10/7 2024/10/7 周一周一35352024/10/7 2024/10/7 周一周一36362024/10/7 2024/10/7 周一周一3737特点特点A 无表型效应，无表型效应，RFLP标记的检测不受环境标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。条件和发育阶段的影响。B RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。C 在非等位的在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，标记之间不存在上位效应，因而互不干扰因而互不干扰2024/10/7 2024/10/7 周一周一3838D RFLP标记起源于基因组标记起源于基因组DNA的自身变异，的自身变异，在数量上几乎不受限制在数量上几乎不受限制E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将辅助育种中需要将RFLP转换成以转换成以PCR为基为基础的标记。础的标记。2024/10/7 2024/10/7 周一周一3939（二）（二）AFLP标记标记AFLP标记是扩增片段长度多态性的简称标记是扩增片段长度多态性的简称 是是RFLP与与PCR两项技术相结合的产物，两项技术相结合的产物，AFLP技术的主要步骤：技术的主要步骤：DNA提取两种限制性内切酶酶切提取两种限制性内切酶酶切DNA寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析。段的选择性扩增扩增产物的电泳分析。由于不同材料由于不同材料由于不同材料由于不同材料DNADNA酶切片段存在差异，因而便酶切片段存在差异，因而便酶切片段存在差异，因而便酶切片段存在差异，因而便产生发扩增产物的多态性。产生发扩增产物的多态性。产生发扩增产物的多态性。产生发扩增产物的多态性。2024/10/7 2024/10/7 周一周一4040l lAFLPAFLP标记的主要特点有：标记的主要特点有：标记的主要特点有：标记的主要特点有：（1 1）由于）由于）由于）由于AFLPAFLP分析可以采用的限制性内切酶及选分析可以采用的限制性内切酶及选分析可以采用的限制性内切酶及选分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产 生的生的生的生的标记数目是无限多的；标记数目是无限多的；标记数目是无限多的；标记数目是无限多的；（2 2）典型的）典型的）典型的）典型的AFLPAFLP分析，每次反应产物的谱带在分析，每次反应产物的谱带在分析，每次反应产物的谱带在分析，每次反应产物的谱带在50-10050-100条之间，所以一次分析可以同时检测条之间，所以一次分析可以同时检测条之间，所以一次分析可以同时检测条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；到多个座位，且多态性极高；到多个座位，且多态性极高；到多个座位，且多态性极高；（3 3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4 4）分辩率高，结果可靠；）分辩率高，结果可靠；）分辩率高，结果可靠；）分辩率高，结果可靠；（5 5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性 带出带出带出带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。现频繁、技术复杂、成本高等缺点。现频繁、技术复杂、成本高等缺点。现频繁、技术复杂、成本高等缺点。2024/10/7 2024/10/7 周一周一4141（三）（三）RAPD标记标记 RAPDRAPD标记的基本原理是利用合成的随机引物标记的基本原理是利用合成的随机引物标记的基本原理是利用合成的随机引物标记的基本原理是利用合成的随机引物（一般为（一般为（一般为（一般为810810个碱基）对基困组个碱基）对基困组个碱基）对基困组个碱基）对基困组DNADNA进行进行进行进行PCRPCR扩增扩增扩增扩增 ，然后电泳检测，然后电泳检测，然后电泳检测，然后电泳检测PCRPCR产物的多态性。产物的多态性。产物的多态性。产物的多态性。2024/10/7 2024/10/7 周一周一4242RAPD标记的主要特点有：标记的主要特点有：（1）不需）不需DNA探针，设计引物也无须知道序探针，设计引物也无须知道序 列信息；列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。）实验重复性较差，结果可靠性较低。2024/10/7 2024/10/7 周一周一4343（四）（四）SSR标记标记又叫微卫星又叫微卫星DNA标记，它是指基因组中存标记，它是指基因组中存在的由在的由2-5个核苷酸为重复单位组成的长个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。分布于真核生物基因组中。SSR标记具有共显性、高多态性和易于检标记具有共显性、高多态性和易于检测等优点，是一种理想的分子标记，测等优点，是一种理想的分子标记，2024/10/7 2024/10/7 周一周一4444SSR标记的主要特点有：标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因）数量丰富，广泛分布于整个基因（2）具有较多的等位性变异；）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。用也较高。2024/10/7 2024/10/7 周一周一4545（五）（五）SNP标记标记 也是以也是以也是以也是以PCRPCR技术为基础的分子标记技术。它是指不同技术为基础的分子标记技术。它是指不同技术为基础的分子标记技术。它是指不同技术为基础的分子标记技术。它是指不同生物个体基因组生物个体基因组生物个体基因组生物个体基因组DNADNA序列之间单个核苷酸的差异，这种差序列之间单个核苷酸的差异，这种差序列之间单个核苷酸的差异，这种差序列之间单个核苷酸的差异，这种差异可以通过设计特异异可以通过设计特异异可以通过设计特异异可以通过设计特异PCRPCR引物扩增和电泳检测显示出来。引物扩增和电泳检测显示出来。引物扩增和电泳检测显示出来。引物扩增和电泳检测显示出来。SNPSNP标记是根据基因组测序结果发展起来的，数量非标记是根据基因组测序结果发展起来的，数量非标记是根据基因组测序结果发展起来的，数量非标记是根据基因组测序结果发展起来的，数量非常丰富。检测常丰富。检测常丰富。检测常丰富。检测SNPSNP的最佳方法是新近发展起来的的最佳方法是新近发展起来的的最佳方法是新近发展起来的的最佳方法是新近发展起来的DNADNA芯片芯片芯片芯片技术。技术。技术。技术。目前目前目前目前SNPSNP作为一种的分子标记技术，已有作为一种的分子标记技术，已有作为一种的分子标记技术，已有作为一种的分子标记技术，已有20002000多个多个多个多个SNPSNP标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植 物上也发展了物上也发展了物上也发展了物上也发展了一些一些一些一些SNPSNP标记。标记。标记。标记。2024/10/7 2024/10/7 周一周一4646DNA分子标记在生物技术中的应用分子标记在生物技术中的应用l lDNANA分子标记是现代生物技术中应用的重要工具，其应用分子标记是现代生物技术中应用的重要工具，其应用分子标记是现代生物技术中应用的重要工具，其应用分子标记是现代生物技术中应用的重要工具，其应用主要包括以下几个方面：主要包括以下几个方面：主要包括以下几个方面：主要包括以下几个方面：构建高密度的遗传连锁图构建高密度的遗传连锁图构建高密度的遗传连锁图构建高密度的遗传连锁图 ：在经典遗传学中由于遗传标记的：在经典遗传学中由于遗传标记的：在经典遗传学中由于遗传标记的：在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。数量较少，只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNADNA分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了分子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供了可能，促进可能，促进可能，促进可能，促进DNADNA指纹的分析。指纹的分析。指纹的分析。指纹的分析。进行基本定位：基本定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的进行基本定位：基本定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的进行基本定位：基本定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的进行基本定位：基本定位就是寻找与目的的基因紧密连锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图遗传标记并确定其在染色体上的位置，高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位更为方便。的建立使目的基因的定位更为方便。的建立使目的基因的定位更为方便。的建立使目的基因的定位更为方便。2