疏清颗粒醇提工艺优化与质量标准提升_高羚毓.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：吉林省产业技术研究与开发项目（）作者简介：高羚毓（），女（汉族），吉林长春人，长春中医药大学在读硕士研究生，主要从事中药制药研究工作通讯作者简介：李银清（），女（汉族），吉林长春人，长春中医药大学副研究员，硕士研究生导师，博士学位，主要从事中药药理学研究与中药产品开发工作疏清颗粒醇提工艺优化与质量标准提升高羚毓，毕 野，邱智东，张荣华，靳梓微，贾 月，李银清（长春中医药大学，吉林 长春）摘要：目的 优化疏清颗粒制备方法中的醇提工艺，提高疏清颗粒的质量标准。方法 以靛玉红的含量作为指标，采用单因素试验，对提取时间、大青叶的粒度、提取温度、滤材目数进行优化，确定最佳提取工艺。建立疏清颗粒中水溶性成分阿魏酸的含量测定方法。结果 确定了醇提过程的工艺参数：大青叶的粉碎粒度为最粗粉，温浸提取，浸渍时间为，目滤布过滤提取液，靛玉红的含量提高了 倍。薄层色谱鉴别和指纹图谱表明，工艺优化对疏清颗粒的物质基础无影响。建立的阿魏酸含量测定方法准确可靠，可以作为疏清颗粒水提工艺的评价标准。结论 工艺优化缩短了企业的生产周期，提高了生产效率，改善了药品的质量，增加水溶性成分的质量标准，以保证产品的一致性。关键词：疏清颗粒；靛玉红；工艺优化；质量标准提高 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：，：，：；疏清颗粒是儿科用于治疗病毒感染疾病的临床常用中成药大品种，被国家基本医疗药品保险目录收录并规定为乙类药品，用量大，应用范围广，临床疗效强，。疏清颗粒生产工艺中包含乙醇和水两种溶媒，颗粒中脂溶性成分在溶化性测定中易出现不溶性沉淀，降低儿童患者依从性。本文以疏清颗粒法定工艺中醇提工艺路线为研究对象，以法定质量标准中规定的含测成分为指标，通过研究醇提路线每一环节中影响药品质量的关键技术参数，探讨工艺参数改变是否对颗粒的物质基础产生影响，同时建立颗粒水提工艺的含量测定方法，为进一步优化疏清颗粒生产工艺、精准提高药品质控标准、科学评价中药制剂质量、降低企业生产降低成本提升产能提供实验支撑，为中药大品种的二次开发和利用提供科学依据。材料与方法 供供试试材材料料 高效液相色谱仪（岛津）；色谱柱：色谱柱（，）；色谱柱（，）；靛玉红标准品（批号：，纯度 ，中检所）；甘草苷标准品、芦丁标准品、甘草素标准品（上海源叶生物科技有限公司，纯度）；大青叶，芦根，桑叶，甘草，石膏从吉林北药药材加工有限公司购进。疏疏清清颗颗粒粒的的制制备备 称取芦根 ，大青叶 ，甘草 ，桑叶 ，加入 的 乙醇浸渍 ，再加入 的乙醇渗滤，流速为 ，合并醇提液，浓缩至相对密度为 。称量石膏 ，加入 水提取 后，与醇提药渣共提，提取 ，过滤，收集滤液。再加入 水进行 次提取，提取时间为 ，过滤，合并水提液，浓缩至相对密度为 。醇提物与水提物混合，与辅料蔗糖、糊精沸腾制粒，得到疏清颗粒。靛靛玉玉红红含含量量测测定定方方法法的的建建立立 色色谱谱条条件件 色谱柱；流动相：甲醇 乙腈 磷酸水（：）等度洗脱；流速：；检测波长：；柱温：；进样体积：。溶溶液液配配制制 醇提液的制备：称量疏清处方芦根 ，大青叶 ，甘草 ，桑叶 ，加入 的 乙醇，室温浸渍，再加入 的 乙醇渗滤，渗漉，合并渗滤液，滤过即得。对照品储备液的制备：精密称定靛玉红对照品，加少量三氯甲烷溶解，甲醇定容至 ，制得 的对照品溶液。供试品溶液的制备：精密吸取醇提液 ，水浴挥干，时珍国医国药 年第 卷第 期 残渣加 水溶解，置分液漏斗中，水液分别用 、三氯甲烷萃取 次，合并三氯甲烷萃取液，水浴挥干，残渣加 三氯甲烷溶解，甲醇定容至 ，即得。方方法法学学考考察察 线线性性关关系系考考察察 取“”项下对照品储备液，依次稀释成、的系列标准溶液，注入高效液相色谱仪（），按“”项下的色谱条件进行测定，以 测定峰面积（）为 轴，靛玉红溶液的浓度为 轴，绘制标准曲线。专专属属性性试试验验 无大青叶的疏清处方，按“”药材醇提液的制备方法制备阴性溶液。精密吸取阴性溶液 ，按“”供试品制备方法制备，注入，按“”项下的色谱条件进行测定，对比醇提液与阴性溶液的色谱图。精精密密度度试试验验 取上述靛玉红对照品溶液（），注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算精密度。重重复复性性试试验验 精密量取醇提液 份，每份 ，按“”方法制备供试品溶液，注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算重复性。稳稳定定性性试试验验 取靛玉红对照品溶液（），分别在制备后、注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算稳定性。加加样样回回收收试试验验 精密量取已知含量醇提液 份，每份，分别加入已知含量、和 的靛玉红标准品，按“”方法制备供试品溶液，注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算加样回收率。靛靛玉玉红红提提取取工工艺艺的的优优化化 滤滤材材目目数数的的考考察察 药材提取过程中，过细的药材粉末可能影响颗粒的溶化性。以靛玉红的含量和静置后产生沉淀的量为指标，选择 目、目和 目的绢布过滤醇提液，选择合适的滤材目数。浸浸渍渍时时间间的的考考察察 称量大青叶 ，芦根 ，桑叶 ，甘草 各 份，置 烧杯中，加入 的 乙醇，于浸渍不同时间点（、）取样 ，测定不同时间点靛玉红的含量变化。同时取 倍量药材进行验证性试验。大大青青叶叶粉粉碎碎粒粒度度的的考考察察 用 乙醇提取不同粉碎粒度的大青叶，分别为未粉碎饮片，最粗粉，粗粉，比较不同粒度大青叶的提取液中靛玉红含量。温温浸浸法法提提取取靛靛玉玉红红 疏清处方置 水浴中浸渍，在 不同时刻取样，测定靛玉红含量随时间变化的曲线。浸浸渍渍液液薄薄层层鉴鉴别别 对照品溶液制备：精密称定靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每 各含 的溶液。供试品溶液：移取浸渍不同时间的醇提液。吸取上述两种溶液各 ，分别点于同一硅胶 薄层板上，以环己烷 三氯甲烷 丙酮（：）为展开剂，展开，取出晾干，在日光下检视。疏疏清清颗颗粒粒指指纹纹图图谱谱 色色谱谱条条件件 色谱柱，（磷酸）（甲醇：乙腈：），流速：，柱温：，进样体积：。溶溶液液的的配配制制 对照品溶液：分别称量甘草素、甘草苷、芦丁、靛玉红对照品，置 容量瓶中，制备成每 含 的混合对照品溶液。供试品溶液：称量浸渍 和温浸的干膏各 ，颗粒，加入 甲醇超声 ，离心 ，微孔滤膜（）滤过，即得。疏疏清清颗颗粒粒薄薄层层鉴鉴别别 大青叶：称量浸膏粉 ，颗粒 ，加入 水超声 ，加入三氯甲烷萃取 次，每次，合并三氯甲烷层，水浴挥干，残渣加 甲醇溶解，即得新工艺和颗粒供试品溶液。称量大青叶对照药材，加入三氯甲烷 超声 ，滤过，滤液水浴挥干，残渣加 溶液，即得大青叶对照药材。吸取上述制备的供试品和对照药材溶液 ，分别点于同一硅胶 板上，以环己烷 三氯甲烷 丙酮（：）为展开剂，取出晾干，喷 的硫酸乙醇，置紫外灯（）下观察。表 洗脱程序时间 桑叶：称量浸膏粉 ，颗粒 ，加入甲醇 超声 ，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇 溶解，即得供试品溶液。称量桑叶对照药材 ，加石油醚 ，超声 ，弃去石油醚，药渣加甲醇 ，超声 ，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇 溶解，即得药材对照品溶液。吸取上述制备的供试品和对照药材溶液 ，分别点于同一硅胶 板上，以甲苯 乙酸乙酯 甲酸（：）为展开剂，取出晾干，置紫外灯（）下观察。芦根：称量浸膏粉 ，颗粒 ，加入三氯甲烷 回流，回流两次，过滤，合并滤液，滤液水浴挥干，残渣加 甲醇溶解，即得供试品溶液。称量芦根对照药材 ，加三氯甲烷 超声 ，滤过，滤液挥干，残渣加 三氯甲烷溶解，即得芦根对照药材溶液。取上述制备的供试品和对照药材溶液，分别点于同一硅胶 板上，以环己烷 乙酸乙酯（：）为展开剂，喷 的硫酸乙醇，加热至，置紫外灯（）下观察。甘草：称量浸膏粉 ，颗粒，加甲醇，超声 ，滤过，滤液水浴蒸干，用 甲醇溶解，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取两次，每次 ，合并正丁醇，再用 的 溶液萃取两次，每次 ，合并碱液，用盐酸调 值至中性，用水饱和正丁醇萃取两次，每次 ，合并正丁醇，以 水洗涤，弃去水液，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇 溶解，即得供试品溶液。称量甘草对照药材 ，加乙醚 ，回流 ，滤过，药渣加甲醇 ，回流 ，滤过，滤液蒸干，残渣加 水溶解，用水饱和正丁醇萃取 次，每次 ，合并正丁醇，用水洗涤 次，每次 ，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇 溶解，即得甘草对照药材溶液。取上述供试品与对照药材溶液 ，分别点于同一 的 硅胶 板上，以乙酸乙酯 甲酸 冰醋酸 水（：）为展开剂，取出晾干，喷 的硫酸乙醇，加热至斑点清晰，置紫外灯（）下观察。质质量量标标准准提提高高 阿阿魏魏酸酸含含量量测测定定方方法法的的建建立立 色谱条件：色谱柱；流动相：乙腈 醋酸水（：）；流速：；检测波长：；柱温：；进样体积：。溶溶液液配配制制 对照品储备液的制备：精密称定阿魏酸对照品，甲醇定容至 ，制备成每 含 阿魏酸溶液。供试品溶液的制备：精密称定 疏清颗粒，加 的 乙醇 ，称定重量，超声 ，乙醇补足重量，取 提取液，加入等体积的 的 乙醇，混合，过 滤膜，即得。方方法法学学考考察察 线线性性关关系系试试验验 取“”阿魏酸对照品储备液，依次稀释成、系列标准溶液，根据“”项下的色谱条件进行测定，以 测定峰面积（）为 时珍国医国药 年第 卷第 期 轴，阿魏酸的浓度为 轴，绘制标准曲线。专专属属性性试试验验 称量无芦根、桑叶的疏清处方，按“”颗粒制备方法制备阴性颗粒。精密称量阴性颗粒，按“”方法制备供试品溶液，注入，按“”项下的色谱条件进行测定，对比供试品溶液与阴性供试品溶液的色谱图。精精密密度度试试验验 分别取上述阿魏酸对照品溶液（），注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算精密度。重重复复性性试试验验 精密称定同一批次的颗粒 份，按“”方法制备供试品溶液，注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算重复性。稳稳定定性性试试验验 精密称定同一批次的颗粒 份，按“”方法制备供试品溶液，室温下，分别在制备后、注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算稳定性。加加样样回回收收试试验验 精密称定已知含量的颗粒 份，分别加入与已知颗粒含量相等的阿魏酸标准品，按“”方法制备供试品溶液，注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算加样回收率。测测定定颗颗粒粒中中阿阿魏魏酸酸的的含含量量 精密称量颗粒 份，每份 ，按“”方法制备供试品溶液，注入，按“”项下的色谱条件进行测定，以峰面积计算颗粒中阿魏酸的含量。结果 方方法法学学考考察察 靛靛玉玉红红标标准准曲曲线线的的建建立立 由图 可知，靛玉红的回归方程为 ，表明靛玉红在 的浓度范围内线性关系良好。专专属属性性考考察察 阴性供试品在靛玉红的保留时间处无色谱峰出现，表明阴性溶液无干扰。见图。（）靛玉红线性标准曲线；（）为阴性供试品；（）为供试品图 靛玉红专属性考察 精精密密度度考考察察 靛玉红峰面积 值为 ，表明此检测精密度良好。见表。重重复复性性考考察察 靛玉红峰面积 值为 ，表明此方法重复性良好。见表。稳稳定定性性试试验验 靛玉红峰面积 值为 ，表明室温下供试品溶液在 之内稳定。见表。表 靛玉红方法学考察试验方法学 精密度 重复性 稳定性 ，方法学考察合格 加加样样回回收收率率试试验验 靛玉红的回收率在 之间，值为 ，表明加样回收率合格。见表。表 靛玉红加样回收率序号加入量 测得量 回收率 ，加样回收率合格 靛靛玉玉红红提提取取工工艺艺优优化化 滤滤材材目目数数的的选选择择 醇提液经过 目，目，目绢布过滤后，含量分别为 ，靛玉红含量无显著性变化，目过滤产生的药材细粉少，选择 目绢布。见图。浸浸渍渍时时间间的的考考察察 至 ，靛玉红的含量基本保持不变，为 ，其中 靛玉红的含量最高。考虑到实际生产的需要，选择浸渍时间 。放大试验得到同样的结果，靛玉红的含量为（）。见图。（）不同目数滤材对靛玉红含量的影响；靛玉红含量随时间变化的曲线图 滤材目数的选择及浸渍时间 大大青青叶叶粉粉碎碎粒粒度度的的考考察察 最粗粉提取液在 溶出平衡，含量为 ；粗粉提取液在 溶出平衡，含量为 。饮片组与最粗粉组（）和粗粉组（）有显著性差异。见图。温温浸浸法法 浸渍时间为，大青叶为最粗粉时，靛玉红 时溶出达到平衡，含量为 。见图。时珍国医国药 年第 卷第 期 （）不同粉碎粒度大青叶中靛玉红随时间变化的曲线；（）不同粉碎粒度大青叶溶出平衡时靛玉红含量；（）最粗粉大青叶 温浸提取；图 不同粉碎粒度及浸渍时间 薄薄层层色色谱谱鉴鉴别别 供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上，分别显相同浅紫红色斑点，表明供试品中存在靛玉红，随时间的延长，紫红色斑点变深，靛玉红含量增加。见图。不同时间点供试品 ；依次为 ，；，为靛玉红标准品图 大青叶薄层色谱鉴别 疏疏清清颗颗粒粒指指纹纹图图谱谱 按“”的方法制备各 批浸渍 、温浸、原工艺的供试品溶液，注入 中。供试品与混合标准溶液的色谱峰对比，为甘草苷，为芦丁，为甘草素，为靛玉红。将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度系统 版”软件，以 为参照图，设定时间宽度为 ，多点校正后进行 峰谱自动匹配，共得到 个特征峰，以中位数法生成对照图谱，进行相似度评价。批浸渍 供试品与对照图谱的相似度为 ，批温浸供试品与对照图谱的相似度为 ，相似度均大于 ，表明指纹图谱的相似度良好。从上述每 批中选择 批供试品，对 批工艺优化前后的供试品溶液进行相似度评价，相似度为 ，相似度良好。观察图 色谱图，没有新物质生成，表明疏清颗粒的物质基础没有变化。见图 。（）混标，甘草苷，芦丁，甘草素，靛玉红；（）疏清颗粒图 疏清颗粒色谱图 疏疏清清颗颗粒粒薄薄层层鉴鉴别别 大青叶、桑叶、芦根、甘草的对照药材与颗粒在 紫外灯下显示相同的斑点，浸渍和温浸的供试品与颗粒供试品斑点差别不大，表明工艺优化前后的样品中存在上述四种药材。见图。：浸渍；：疏清颗粒；：温浸图 批供试品指纹图谱（）芦根，（）大青叶，（）甘草，（）桑叶，对照药材，浸渍；温浸工艺，颗粒图 工艺优化前后薄层鉴别图 质质量量标标准准提提高高 方方法法学学考考察察 阿阿魏魏酸酸标标准准曲曲线线 阿魏酸的回归方程为 ，结果表明阿魏酸在 的浓度范围内线性关系良好。见图。专专属属性性试试验验 阴性供试品在阿魏酸的保留时间处无色谱峰出现，表明阴性溶液无干扰。见图。精精密密度度试试验验 阿魏酸峰面积 值为 ，符合要求，表明此检测精密度良好。见表。重重复复性性试试验验 阿魏酸峰面积 值为 ，符合要求，表明该方法重复性良好。见表。稳稳定定性性试试验验 阿魏酸峰面积 值为 ，符合要求，表明阿魏酸在 内稳定。见表。加加样样回回收收率率试试验验 阿魏酸的回收率分别在 之间，值为 ，符合规定，表明加样回收率合格。见表。样样品品含含量量测测定定 精密称定疏清颗粒 ，测得三批疏清颗粒中阿魏酸的含量接近，为 ，值为 。讨论疏清颗粒由生石膏、大青叶、桑叶、芦根、甘草组成，是以经典名方“白虎汤”为基础加减化裁而来的临床验方开发较早，时珍国医国药 年第 卷第 期制备工艺和质量标准相对不完善，生产周期长，质量控制难度增加，容易引起不同生产批次药品质量不稳定，导致临床疗效差异性增加。为解决原生产工艺中产品生产周期长、成品进行溶化性检查时出现不溶物、产品质量标准提高的问题，我们从药材粉碎粒度、浸提温度、表面活性剂等角度入手，对制剂工艺优化和质量标准提高进行了实验研究。阿魏酸线性标准曲线；阿魏酸专属性考察（）为标准品，（）为阴性供试品图 方法学考察结果表 阿魏酸方法学考察方法学 精密度 重复性 稳定性 ，方法学考察合格表 阿魏酸加样回收率序号加入量 测得量 回收率 ，加样回收率合格不同粉碎粒度对靛玉红溶出影响显著。原制备工艺中对大青叶粉碎粒度没有做出明确规定，我们采用单因素考察法，分别考察不同的粉碎粒度对大青叶中靛玉红溶出的影响。粉碎度单因素考察结果显示，用 乙醇提取，最粗粉大青叶的靛玉红含量最高，高于未粉粹的大青叶饮片和大青叶细粉，在不同粉碎粒度中，最粗粉为含量拐点，结果表明过粗或过细的药材均影响药材成分的提取。缩短浸渍提取时间，疏清颗粒物质基础没有明显变化，提取效率提高。原工艺中醇提路线为四种药材采用乙醇浸渍渗漉提取 ，我们采用薄层色谱法、单因素考察法和指纹图谱法，乙醇浓度不变情况下，将浸渍 缩短为浸渍 。薄层色谱结果显示，采用浸渍提取法得到的浸膏与成品比较，差异不显著，说明缩短提取时间，药品物质基础基本没有明显改变。单因素考察结果显示，靛玉红含量随着浸渍时间的延长增加，后靛玉红的溶出达到平衡，含测结果显示，浸渍提取 与 的靛玉红含量无显著性差异，生产效率将提高 倍，可有效避免中药材资源浪费。浸提温度单因素考察实验表明，温度与靛玉红含量呈正相关，温度升高，靛玉红在乙醇中的提取率增加。且与常温浸渍相比，温浸提取液中的靛玉红含量增加了 倍，平衡时间由 增加至 。原工艺靛玉红从大青叶至醇提液的转移率只有，工艺优化后转移率显著提高。薄层色谱与指纹图谱结果显示，提高浸提温度至，疏清颗粒物质基础没有明显变化。质量标准含测物质选择应基于药物临床功效探讨结果。药品从研发、临床、审批到生产流通使用、监测直至淘汰退市的全链条监管模式中，药品临床疗效直接关系到患者健康，应是评价药品质量的最关键指标。中药制剂质量标准研究应根据处方组成、制备工艺、基准物质的理化性质、制剂的特性和稳定性的特点，有针对性地选择并确定质量标准控制指标，并应结合相关科学技术的发展，不断优化生产工艺、完善质量标准的内容，从而提高中药制剂的质量控制水平，体现药品质量全生命周期管理，保证药品的安全性和有效性。疏清颗粒现行质量检查中，只规定了大青叶中靛玉红的含量要求，难以全面评价药品质量。运用现代科学技术，不断优化改进生产工艺，不断完善质量标准的科学性、合理性、可行性，是研究者的重要任务。疏清颗粒除大青叶外，芦根、桑叶、甘草中均含大量活性成分，应当在标准中予以考虑。大量文献证明，阿魏酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功能，在芦根和桑叶中都有较大量存在，与疏清颗粒临床主治功能密切相关，且检测分析方法准确稳定，易于操作，非常适宜作为质控含测标志物。因此，我们选择对阿魏酸含量测定进行了研究，为提升疏清颗粒的质量标准提供实验支撑。然而仅依据几种化学物质对疏清颗粒的工艺和质量进行评价有一定的局限性，后续研究将通过网络药理学手段研究疾病靶点与疏清颗粒中活性成分的交互作用，建立更准确的质量标准。参考文献：王紫嫣 基于 信号通路探究疏清颗粒抗甲型流感病毒 的作用 吉林大学硕士学位论文，张 宇 长春地区 的分离鉴定及疏清颗粒的抗病毒药效学研究 吉林大学硕士学位论文，车宏伟，杨海宁，王登才，等 疏清颗粒质量标准提高研究 中国医药导报，（）：，卢 琳，朱立彬，黄志军，等 基于药效筛选和正交试验优选小儿牛蒡子止咳糖浆的制备工艺 中国药师，（）：国家药典委员会 中国药典 北京：中国医药科技出版社，：崔日宝 河西走廊不同产地原料及浸渍工艺对赤霞珠干红葡萄酒挥发性成分的影响 甘肃农业大学硕士学位论文，杨海宁 发酵与非发酵疏清口服液初步比较研究 安徽中医药大学硕士学位论文，李 洪，张 静，王 麟，等 白洋淀芦根的鉴别、质量控制及临床应用研究 科技视界，（）：代雪平，宋汉敏，李振国 法测定不同产地芦根中阿魏酸的含量 中医研究，（）：马 融，胡思源，李新民，等 疏清颗粒治疗小儿急性上呼吸道感染的上市后再评价 药物评价研究，（）：曹利华，杨 雪，赵院院，等 基于网络药理学探讨芦根对慢性支气管炎的影响及作用机制 中药药理与临床，（）：黄 羚，刘铁钢，白 辰，等 基于数据挖掘和网络药理学的谷晓红教授治疗小儿急性上呼吸道感染的研究 世界中医药，（）：时珍国医国药 年第 卷第 期