液相色谱原理基础知识1.pdf

1Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited岛津液相色谱操作培训岛津液相色谱操作培训岛津国际贸易（上海）有限公司分析仪器事业部分析中心2Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited免费咨询电话800-810-0439400-650-0439分析中心电话北京：010-85252352上海：021-22013645广州：020-87108603沈阳：024-23255577岛津网站地址http:/耗材购买电话800-820-7730【岛津技迩（上海）商贸有限公司】有任何问题请联系我们3Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited1969GPC系统开发1972LC-1（LC-830）销售与DuPont签订许可合同后制造销售1978LC-3A系列销售CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征1981LC-4A系列销售内置微型计算机的全自动HPLC1982LC-5A系列销售世界上首创的微量型LC对应HPLC1984LC-6A系列销售世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身1991LC-10A系列销售世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器1997LC-VP系列销售采用有效性支持功能的积木型HPLC2000LC-2010销售追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC2004LC-20A Prominence销售为分析实验室带来革新的HPLC 2010 LC-15C销售为了让LC分析更为便捷2010 LC-30A Nexera销售130MPa耐压系统，低系统容量，高温分析和样品自动前处理岛津HPLC的历史Started in 1969在售产品在售产品4Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited岛津HPLC的历史2000THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20101997THECNLOGYBREAKTHROUGHFlexible HPLC System with Micro-stroke Volume Solvent Delivery UnitLC-VP2004THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20A Prominence2010THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-15C Essentia2008THECNLOGYBREAKTHROUGHUFLC Prominence2010THECNLOGYBREAKTHROUGHUHPLC LC-30A Nexera5Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedLC-20A Prominence6Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited基础知识讲解内容1、色谱基础知识2、硬件基础知识3、定量基础知识4、维护基础知识7Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited第一部分色谱基础知识8Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素混合物色谱分离组分9Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited色谱发展史?20世纪初，俄国植物学家M.S.Tswett提出经典液相色谱法；?20-30年代，柱分配色谱和纸色谱；?50年代，气相色谱，薄层色谱；?60年代，凝胶渗透色谱及高效液相色谱；?70年代，高效毛细管气相色谱法；?80年代，电色谱；?90年代，光色谱。10Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited0.00.51.01.52.02.53.0min0100200300400500mVMethyl ParabenEthyl ParabenPropyl ParabenButyl Paraben?色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术?流动相：携带样品流过整个系统的流体?固定相：静止不动的一相，色谱柱色谱定义?色谱是一种分离技术.?色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量11Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited色谱分类?高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography(HPLC)?气相色谱Gas Chromatography(GC)?薄层色谱Thin-Layer Chromatography(TLC)?毛细管电泳Capillary Electrophoresis(CE)12Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法?适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析?流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用HPLC vs GC?气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法?适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析?流动相只起运载样品分子的能力13Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedHPLC简易流程图数据处理系统数据处理系统输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器储液瓶输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器储液瓶14Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedHPLC特点?分离性能好?灵敏度高（10-910-12 g）?选择性高（同分异构，旋光异构）?分析速度快?进样量小（1-100 L）15Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedHPLC分类?反相色谱（reversed phase chromatography）?离子对色谱（ion-pair chromatography）?正相色谱（normal phase chromatography）?离子交换色谱（ion exchange chromatography）?尺寸排阻色谱（GPC/GFC）16Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited反相色谱?C18(ODS)?C8(octyl)?C4(butyl)?苯基?TMS?氰基-O-Si(CH3)2-C18H37SiO2非极性非极性非极性非极性流动相的极性大于固定相的极性17Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited相互作用力是什么?OHOHC18(ODS)强弱强弱疏水性疏水性疏水性疏水性SiO218Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited疏水性?如果样品有 CH3CH2CH2-:碳链:芳香基?如果样品有 COOH:羧基 NH2:氨基 OH:羟基作用力强作用力强作用力强作用力强作用力弱作用力弱作用力弱作用力弱19Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited反相色谱流动相的选择?优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂。?在有缓冲液的情况下，缓冲液的浓度和pH值非常重要。20Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited流动相极性变化对分离的影响2 20 0%水水水水3 30%0%水水水水4 40 0%水水水水1:对羟基苯甲酸甲酯2:对羟基苯甲酸乙酯3:对羟基苯甲酸丙酯4:对羟基苯甲酸丁酯有机相:甲醇有机相:甲醇21Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited固定相极性变化对分离的影响C18(ODS)强强样品样品SiO2C8样品样品一般一般SiO2样品样品C4弱弱SiO222Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?分析条件?柱:Shim-pack CLC-ODS?流动相:MeOH:H2O=7:3?流速:1.0 mL/min?温度:40?进样体积:10 L?检测器:UV-254 nm?峰1.苯甲酸甲酯2.苯甲酸乙酯3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯ODS CODS C8 8TMS TMS 固定相极性变化对分离的影响23Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited反相离子对色谱?原理：原理：样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水性离子对，而为反相色谱固定相保留?固定相：固定相：疏水性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂或键合的硅胶?流动相：流动相：水（缓冲液）+离子对试剂+有机溶剂?离子对试剂：离子对试剂：所带电荷与待测离子相反24Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?阴离子化合物 氢氧化四丁基铵 溴化四丁基铵?阳离子化合物 丁烷基磺酸钠（C4）戊烷基磺酸钠（C5）己烷基磺酸钠（C6）庚烷基磺酸钠（C7）辛烷基磺酸钠（C8）癸烷基磺酸钠（C10）十二烷基磺酸钠（SDS）常用离子对试剂25Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited反相离子对色谱流动相的选择?离子对试剂的类型所带电荷与待测物质相反?离子对试剂的浓度10-410-2 mol/L在一定范围内，浓度越大，被分离物的保留值越大?流动相的 pH 26Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited 阴阳离子表面活性剂 大分子脂肪酸 烷基磺酸盐和芳香硫酸盐 含氮化合物 生物碱 水溶性维生素 酚类?有机酸、碱、盐的分离包括：反相离子对色谱应用27Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited正相色谱?硅 胶 柱:常用?氰 基 柱:常用?氨 基 柱:分析糖?二醇基柱:分析蛋白质硅胶硅胶SiO2SiO2-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)化学键合相化学键合相流动相的极性小于固定相的极性28Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited相互作用力是什么?OHHOSiOHSiOH强强强强弱弱弱弱非常弱非常弱非常弱非常弱氢键力氢键力氢键力氢键力29Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited氢键力?如果样品有 COOH:羧基 NH2:氨基 OH:羟基氢键力强?如果样品没有任何官能团，如碳水化合物?如果样品有大的基团,由于空间位阻氢键力弱30Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited正相模式下流动相的选择?主要试剂主要试剂?烷烃（戊烷,己烷,庚烷,辛烷）?芳香烃（苯,甲苯,二甲苯）?二氯甲烷?氯仿?四氯化碳?辅助试剂辅助试剂?甲基-t-丁基醚（MTBE），乙醚，四氢呋喃（THF），二氧杂环乙烷，嘧啶，乙酸乙酯，乙腈，丙酮，异丙醇，乙醇，甲醇为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。31Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited流动相极性变化对分离的影响0%0%甲醇甲醇甲醇甲醇2%2%甲醇甲醇甲醇甲醇5%5%甲醇甲醇甲醇甲醇1:邻苯二甲酸二辛酯2:邻苯二甲酸二丁酯3:邻苯二甲酸二乙酯4:邻苯二甲酸二甲酯主要试剂主要试剂:己烷己烷32Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?反相色谱流动相极性大于固定相极性适用于能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物分离?正相色谱流动相极性小于固定相极性适用于不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物的分离和制备HPLC反相色谱与正相色谱的对比33Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?反相 保留时间重现性好 固定相耐用?正相 对立体异构体有很好的分离（Vitamin E等）保留时间重现性稍差反相色谱与正相色谱的对比34Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited离子交换色谱?原理：利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离?固定相：离子交换树脂?流动相：水缓冲溶液（常用）或有机溶剂与水缓冲溶液的混合液离子交换色谱所用的缓冲液：阴离子分离：氢氧化物、硼酸盐、碳酸盐、酚盐和两性离子等阳离子分离：矿物酸，如硝酸、盐酸、硫酸和甲基磺酸等35Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedN+RRR样品样品SO3-样品样品+离子吸引力离子吸引力离子交换色谱作用力36Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited离子交换色谱应用?生物领域（蛋白质,农药,氨基酸分析）?离子分析?阳离子交换剂?强阳离子交换剂（SCX）（R-SO3-）?弱阳离子交换剂（WCX）（R-COO-）?阴离子交换剂?强阴离子交换剂（SAX）（R4N+）?弱阴离子交换剂（WAX）（DEAE）37Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.Limited?原理：原理：利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来分离的液相色谱方法?固定相：固定相：一种表面惰性、具有一定孔径的多孔凝胶?应用：应用：聚合物及生命科学领域尺寸排阻色谱法（SEC）38Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedSEC分类?凝胶渗透色谱（凝胶渗透色谱（GPC）?主要用于聚合物领域?以有机溶剂为流动相（氯仿，THF，DMF）?常用固定相填料：苯乙烯二乙烯基苯共聚物?凝胶过滤色谱（凝胶过滤色谱（GFC）?主要用于生命科学领域?以水溶液为流动相?常用固定相填料：亲水性有机凝胶（葡聚糖，琼脂糖，聚丙烯酰胺等）39Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedGPC分离原理GPC分离原理?固定相是固定相是多孔填料多孔填料，小分子样品可以进入孔径内部，小分子样品可以进入孔径内部?样品与固定相之间样品与固定相之间无作用力无作用力?保留时间保留时间不同不同孔穴孔穴填充物颗粒大中小填充物颗粒大中小样品样品40Shimadzu International Trading(Shanghai)Co.LimitedLog (MW)排阻极限排阻极限渗透极限渗透极限VGPC分离原理GPC分离原理