6-核酸的性质及研究方法.pdf
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1、核酸的性质及研究方法-介绍核酸的水解、紫外吸收、变性、复性、杂交及核酸基本研究方法 核酸的水解 酸水解 磷酸酯键与糖苷键对酸的敏感程度不同。磷酸酯键比糖苷键稳定;嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸敏感;嘌呤与脱氧核糖的糖苷键最不稳定糖苷键磷酸酯键 碱水解 RNA磷酸酯键易被碱水解;DNA磷酸酯键对碱稳定 原因:RNA核糖上2-OH基,在碱性条件下形成磷酸三酯,磷酸三酯极不稳定,随即水解,产生2,3环磷酸酯,进而分解成2,3核苷酸 DNA核糖上无2-OH基,不能形成磷酸三酯中间物因此可以抵抗碱水解。酶水解ab 外切酶蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶 内切酶 牛胰核糖核酸酶
2、 专一性切割位点:嘧啶核苷-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键 产物:3-嘧啶核苷酸;或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。水解机制:同碱相似。内切酶 核糖核酸酶T1 专一性切割位点:3-鸟苷酸与其相邻的5-核苷酸之间的连键产物:3-鸟苷酸;或以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸。核糖核酸酶T2 专一性切割位点:3-腺苷酸A与其相邻的5-核苷酸之间的连键 产物:3-腺苷酸结尾的寡核苷酸。内切酶牛胰脱氧核糖核酸酶:切断双链或单链DNA成为5-磷酸为末端的寡核苷酸,平均长度4个核苷酸。牛脾脱氧核糖核酸酶:切断双链或单链DNA成为3-磷酸为末端的寡核苷酸,平均长度6个核苷酸。限制性内切酶1979年流感嗜血菌迅速降解外
3、源噬菌体限制内切酶的作用,能降解外源而对自身顺序无作用。特点A、切割位点往往是回文结构B、具有高度专一性,识别双链特定的位点,将两条链切开成粘性,平头末端C、用于染色体结构分析、基因测序的分析、基因的体外重组Palindrome,Restriction Enzyme,Sticky EndsGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCSticky Ends(Cohesive Ends)EcoRICIVIC,MadamGet An Apple To The ClassGAATTCGAATTCArber,Nathans,Smith(1978)核酸的紫外吸收 碱基的共轭双键决定了核酸有紫外吸收 最
4、大光吸收值260nm,是核酸定量以及定性的基础 用A260/A280的比值可以判断样品的纯度:纯DNA的A260/A280比值应1.8,纯RNA应2.0 根据紫外吸光值可计算核酸含量:1A260=50g/mL双链DNA;1A260=40 g/mL单链DNA(或RNA)1A260=20 g/mL寡核苷酸 先测定溶液中核酸的磷的含量及紫外吸收值,然后可以求出摩尔吸光系数(P)值(P)=A/CL 单核苷酸(P)值大于单链多核苷酸 单链核苷酸(P)值大于双链核苷酸 因此核酸变性时,(P)值增高,称增色效应;核酸复性时,(P)值降低,称减色效应。WLAP98.30 核酸的变性 概念:双螺旋区氢键的断裂,
5、变成单链,不涉及共价键,磷酸二酯键断裂降解。引起变性的因素 温度的升高 碱酸改变 尿素、甲醛等变性剂 变性的特点 结构变成无规则线团 紫外吸收升高、粘度降低、沉降速率增高、比旋下降、滴定曲线改变、生物功能减少或丧失 温度引起变性爆发式,变性发生在很窄的温度范围,有一个相变过程。熔解温度(Tm值)双螺旋失去一半时的温度,82-95影响DNATm的因素DNA均一性均质DNA熔解,较窄的温度范围内异质DNA熔解,较宽的温度范围内G-C含量G-C含量越高Tm值愈高原因:G-C间形成三对氢键测定Tm可以推算出DNA碱基的百分组成;经验公式:XG+C=(Tm-69.3)2.44 介质离子强度离子强度较低的
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