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实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用
【摘要】 目的：建立检测阴道加德纳菌的实时荧光定量PCR方法，用于细菌性阴道病的诊断。方法：按照Amsel诊断标准诊断细菌性阴道病；定性PCR检测患者阴道分泌物中的阴道加德纳菌；实时荧光定量PCR测定患者阴道分泌物中的阴道加德纳菌的DNA含量，同时测定标本中总的细菌16Sr RNA的DNA含量进行校正，即用阴道加德纳菌的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量比值来表示阴道加德纳菌的相对含量。用受试者工作曲线(ROC)评价对细菌性阴道病的诊断价值。结果：定性PCR的特异度为%，敏感度为%。实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌含量的线性范围1×10～1×105拷贝数/ml。阴道加德纳菌在细菌性阴道病中的相对含量为 340 0，明显高于霉菌性阴道炎、其他阴道炎()及健康体检者()，但与滴虫性阴道炎无明显差异。ROC曲线分析结果显示，曲线下面积为，当阴道加德纳菌的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量的截断值为 603 5时，其诊断细菌性阴道病的总体敏感度和特异度分别为%和%。结论：实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法敏感度和特异度较高，准确性和重复性良好。对细菌性阴道病的诊断有一定的临床应用价值。
【关键词】 阴道加德纳菌 细菌性阴道病 实时荧光定量PCR 诊断价值
细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV) 是育龄期妇女常见疾病。在BV患者与健康妇女中,阴道加德纳菌( gardnerella vaginalis ,GV)检出率存在明显差异。在BV的微生物菌群中GV处于优势地位,数量明显高于其他非正常菌群[1]。目前对阴道加德纳菌的实验室诊断主要有直接涂片革兰染色找线索细胞、细菌分离培养、免疫荧光法以及PCR 等[2～4]。本实验建立检测阴道加德纳菌的实时荧光定量PCR实验诊断方法，用于细菌性阴道病的快速诊断。
1 资料与方法
　研究对象 2008年3月～2008年5月在本院妇科门诊就诊者141例,通过盐水湿片法对阴道分泌物进行检查，按照Amsel诊断标准:①阴道pH值；②阴道分泌物增多、稀薄、有异味；③阴道分泌物加10%KOH可闻到鱼腥味；④涂片可见线索细胞。以上4项指标中3项阳性者判定为BV，共44例。滴虫性阴道炎12例，霉菌性阴道炎25例，其他阴道炎30例，健康体检者30名。患者主诉有程度不同的阴道分泌物异常，外阴瘙痒，泌尿系症状及腰痛和下腹痛等症状，病程为3～10天,年龄23～50岁,均已婚未孕，就诊前3天无阴道灌洗和用药。月经期和绝经后妇女除外。
　主要试剂与仪器 DNA聚合酶及其缓冲液、Mg2＋、dNTPs、RNA酶、PCR产物纯化试剂盒、SYBR Premix Ex Taq(大连宝生物有限公司)，低温离心机，普通PCR仪，琼脂糖凝胶电泳仪，凝胶照像系统，DU紫外分光光度仪，ABI7500PCR仪。
　引物设计与合成 阴道加德纳菌的引物合成参照文献,序列如下:上游引物：5′TTACTGGTGTATCACTGTAAGG3′,下游引物：5′CCGTCACAGGCTGAACAGT3′；16Sr RNA的引物合成参照文献，序列上游引物：5′AGGAGGTGATCCAACCGCA3′,下游引物：5′AACTGGAGGAAGGTGGGGAT3′，由上海生物有限公司合成。
　模板制备 将溶于无菌生理盐水的阴道分泌物，13000g/min离心30min,弃上清，加入400μl溶菌酶裂解液[5mmol/L NaCl，20mmol/L TrisHCl (pH )，1mmol/L EDTA，8%蔗糖，10mg/ml溶菌酶]，置37℃水浴箱20min；加入500μg/ml RNA酶10μl，置37℃水浴箱10min；加入100μl 10%十二烷基硫酸钠，置37℃水浴箱30min；用饱和酚/氯仿/异戊醇抽提上层水相3次，经预冷无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤沉淀2次，室温风干，最终溶解于20μl的TE缓冲液中，置-20℃保存备用。
　PCR扩增 PCR反应体系为10×μl，dNTPs(各 mmol/L)2μl，TAKARA Taqμl,MgCl2(25 mmol/L)μl,上下游引物分别各为μl,模板为3μl，用双蒸水补足至25μl。PCR循环参数为：94℃预变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 1min,35个循环，最后72℃ 5min结束反应(阴道加德纳菌和16Sr RNA的循环参数相同)。
　标准品DNA制备 从PCR扩增出的GV的DNA片段和16Sr RNA的DNA片段用PCR纯化试剂盒进行纯化。纯化后用紫外分光光度计测其OD260/280及其浓度。用双蒸水将其浓度调整，稀释成不同浓度梯度相当于1×105～1×10拷贝数的标准品并绘制标准曲线。同时对纯化后的产物进行测序(大连宝生物有限公司）。
　荧光定量PCR 反应体系为20μl，包括：SYBR Premix Ex Taq(2×)10μl,上下游引物各为μl，ROX Refence DyeII(50×)μl,DNA模板μl，用双蒸水补足至20μl。PCR循环使用两步法，具体参数为:95℃ 10s，一个循环;95℃ 5s,55℃ 34s,40个循环。最后95℃ 15s,60℃ 1 min,95℃ 15s,做溶解曲线。
　荧光定量PCR结果计算 调节基线至适宜处,各荧光曲线与基线的交叉点即为Ct值，根据标准曲线上的浓度和Ct值的对应关系,可求出各待测标本的初始浓度。
　重复性试验 对高、中、低不同浓度的DAN模板连续5次进行荧光定量PCR反应，每次各浓度做5个平行管，计算试验内以及试验间Ct的变异系数。
　统计分析 使用统计软件，各组间GV/16Sr RNA的DNA含量差异均用MannWhitney U秩和检验分析。BV组作为测定组，非BV组作为参照组，将两组的检测结果用ROC曲线进行统计学分析，用来评价检验性能。
　　2 结 果
　定性PCR测定结果 对141份标本进行GV基因片段普通PCR，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，可见332 bp左右的特异性条带，见图1。对其进行序列分析，结果进行Blast同源性比较，扩增DNA片段与L08167序列符合率为100%。其中依照Amsel诊断标准，44份确诊为BV的标本中GV阳性41份，12份阴道滴虫标本中GV阳性8份，25份阴道霉菌病标本中GV阳性21份，30份其他阴道炎标本中GV阳性25份，30份健康体检者标本中GV阳性12份。由此可知，其特异度为%，敏感度%，准确度%，阳性结果的预测值为%，阴性结果的预测值为%，见表1。表1 14份标本定性PCR检测结果份
　定量PCR标准曲线 GV和16Sr RNA纯化后的OD260/280分别为和，浓度为μg/ml和μg/ml。当GV和16Sr RNA纯化产物经过倍比稀释后，其稀释浓度分别在×10-6～×10-10μg/ml和×10-6～×10-1μg/ml范围内时，GV和16Sr RNA的标准曲线回归方程分别为：Ct=- logC0+和Ct=- logC0+,线性范围达1×105～1×10拷贝数/ml,Ct值和初始模板浓度对数值的相关系数分别为和，见图2、图3。
　重复性试验 取高、中、低3种浓度的样本A、B、C，分别重复测定5次，测其批内CV%值分别为%、%、%；再连续5天测定，其批间CV%值为%、%、%，表明本方法的批内和批间重复性均较好，见表2。图2 GV的标准曲线图图3 16Sr RNA的标准曲线图表2 实时荧光定量PCR检测GV的重复性
　各组标本中GV/16Sr RNA的DNA含量比较 GV在BV中的水平明显高于霉菌性阴道炎、其他阴道炎及健康体检者，但与滴虫性阴道炎无明显差异，见表3。表3 各组标本中GV/16Sr RNA的测定结果标本来源n/例GV含量
　GV/16Sr RNA的ROC曲线分析 BV组和非BV组共107例，其中BV组41例，GV/16Sr RNA水平≥ 603 5者为阳性38例， 603 5者为阴性3例；非BV组66例，GV/16Sr RNA阳性13例，GV/16Sr RNA阴性53例，见图4。曲线下面积为，标准误为，敏感度为%，特异度为%，准确度为85%，阳性预测值为%，阴性预测值为%,阳性似然比为，阴性似然比为。
3 讨 论
BV是阴道内乳酸杆菌被另一组有特点的细菌所取代，同时伴有阴道分泌物性质改变的一组综合图4 GV/16SrRNA的比值诊断细菌性
阴道病的受试者工作曲线征。通过定性PCR的结果可知，PCR的特异性为%(31/97)，敏感度%。一方面本方法中BV患者和健康体检者的GV检出率比李连青等的检出率高，可能是使用了不同的检测方法；PCR法具有较高的敏感度但是特异度相对较低,主要原因为阴道加德纳菌为阴道内寄居菌，BV、滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎、其他阴道炎患者及健康体检者中均能检测到此菌，因此，不能仅通过普通PCR对BV进行诊断，需采用定量研究。
本实验建立了实时荧光定量PCR检测GV的方法，具有准确、灵敏、特异、简单等特点，且重复性好，批内、批间变异系数分别为%～%、%～%。
本实验标本的采集中有很多重要的因素需要考虑，如样本选取部位的不同、获得量的不同等，这些都会影响实时荧光定量PCR检测GV的DNA含量。为了避免这些问题，笔者用总的细菌16Sr RNA的DNA含量进行校正，即GV的DNA含量/16Sr RNA的DNA含量的比值作为GV的DNA含量。
本研究对BV、滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎、其他阴道炎和健康体检者阴道分泌物标本中的GV和16Sr RNA的DNA含量进行了定量分析。结果BV组中GV的DNA含量较霉菌性阴道炎，其他阴道炎和健康体检者显着增高，这说明GV作为BV的诊断具有较好的特异性。但是与滴虫性阴道炎无显着差异，可能原因为滴虫性阴道炎感染的同时合并细菌性阴道病感染，或滴虫性阴道炎感染导致GV含量的增加，这些还需进一步研究证实。
ROC曲线分析结果显示，曲线下面积=，当截断值为 603 5时，GV/16Sr RNA的敏感度和特异度分别为%和%。Amsel标准作为临床诊断BV最常用的标准，经盐水湿片法，诊断为BV的44例标本中有41例PCR检测为GV阳性，高于此截断值的有38例。97例为BV阴性的患者，有66例PCR检测为GV阳性，高于此截断值的有13例，其中7例为阴道滴虫标本，原因可能是：①盐水湿片法对GV的检出率不高，取决于诸多因素，其中取材部位和所取量的多少为最重要的影响因素；②技术上存在问题；③滴虫性阴道炎的发生可能与GV存在一定的关系，须经进一步的研究证实。通过研究有可能改善ROC曲线分析结果。
总之，本实验建立的实时荧光定量PCR检测GV的方法，灵敏度高，重复性好，能准确定量GV的DNA含量，用于细菌性阴道病的诊断。
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