人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定.docx
《人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定.docx(10页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定【摘要】 目的:利用基因工程技术克隆TRAIL基因全长cDNA,并构建其原核表达载体. 方法:从人胎盘中提取总RNA,利用RTPCR技术扩增了TRAIL,将其连接于克隆载体pMD18T中,并通过酶切及测序鉴定载体构建的正确性. 结果:应用RTPCR技术和BamH和EcoR双酶切成功获得1049 bp的目的片段,测序分析结果表明该基因序列与报道的TRAIL基因片段的序列完全相同. 结论:成功克隆了TRAIL基因的cDNA全长,为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.【关键词】 肿瘤坏死因子;细胞凋亡;配体;RTPCR;序列测定;人胎盘 0引言 1995年Wi
2、ley和Pitt首次从人的表达标签文库中发现一个与肿瘤坏死因子家族基因序列具有高度同源性的DNA克隆,其表达的蛋白具有诱导细胞凋亡的功能,因而将其命名为肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体1-2. 作为一种新的凋亡诱导配体,肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)自发现以来,就一直倍受关注. 有关TRAIL和TRAIL受体以及其信号转导通路的研究己取得很大进展,而TRAIL特异性诱导肿瘤细胞凋亡的分子调控机制目前尚未阐明. 作为一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡且无明显毒副作用的分子,TRAIL极有可能成为新的抗肿瘤制剂3-4. 研究表明,TRAIL在选择性诱导肿瘤细胞凋亡的同时对正常组织没有明显细胞毒性,
3、并且和放、化疗有协同作用,使得TRAIL在肿瘤的治疗上具有广阔的前景5-6. 我们采用RTPCR方法克隆了TRAIL全长的基因片段,经酶切和测序证实其正确性,为进一步研究及临床应用奠定基础. 1材料和方法 材料大肠杆菌DH5由第四军医大学西京医院妇产科实验室保存,pMD18T载体、EcoRI, BamHI内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000购自大连TaKaRa公司,胰蛋白胨,酵母提取物购自英国OXOID LTD公司,质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司,反转录试剂盒购自Fermentas公司,PCR引物由上海博亚生物工程有限公司合成. 方法 引
4、物的设计与合成根据GenBank报道的TRAIL基因的序列并参照已发表的文献设计合成两条引物. 上游引物P1序列为: 5GAATTCcggctgcctggctgacttac3,划线处为EcoR的酶切位点;下游引物P2序列为: 5GGATCCtttttggttgtggctgctctac3,划线处为BamH的酶切位点. 胎盘组织中总RNA提取采用Trizol一步法提取人胎盘组织中总RNA. 称取100 mg新鲜人胎盘组织,加入1 mL Trizol匀浆,裂解5 min. 加入氯仿进行液相分离. 取上层水相,转至另一离心管中. 加异丙醇沉淀,离心10 min后弃上清,RNA沉淀于管底. 加700 m
5、L/L乙醇洗涤,温和震荡离心管,悬浮沉淀. 再次离心5 min;尽量弃上清;37干燥后,溶于DEPC水中. 取其中2 L溶液紫外分光光度计定量,其余贮存于-80待用. PCR取5 L总RNA,按Fermentas试剂盒的说明进行操作. 扩增参数为:70水浴5 min,37水浴5 min,42水浴60 min, 70水浴15 min,冰浴,待用. 然后以cDNA为模板,PCR反应条件为:95变性3 min后,按94 30 s,55 30 s,72 1 min的顺序循环30次,再于72延伸7 min. 取PCR产物5 L在含溴化乙啶的10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳. 产物的纯化、克隆与鉴定PCR
6、扩增产物电泳结束后,在紫外检测仪下切取所需大小的凝胶片段,按凝胶回收试剂盒操作说明第一次回收目的片断. 将回收产物用EcoRI和BamH内切酶进行双酶切第二次回收目的凝胶片段,酶切产物在含溴化乙啶的10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳,缓冲液为TBE,电泳结束后,在紫外检测仪下切取目标片段,第三次回收. 取凝胶回收纯化的PCR产物4 L加入pMD18T载体1 L, Ligation Solution 5 L, 16连接过夜. 连接产物转化感受态细菌DH5,然后将连接产物涂布于含100 g/mL氨苄青霉素的固体LB培养基平板中,37培养过夜. 挑取单菌落加入5 mL含100 g/mL氨苄青霉素的液体
7、LB培养基试管中,37培养过夜. 采用质粒抽提试剂盒进行质粒抽提,对质粒进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定,鉴定阳性的载体送大连TAKARA公司测序. 将测序证实完全正确的序列命名为pMD18TTRAIL,保存菌种. 2结果 基因的克隆提取胎盘组织总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此为模板进行PCR, PCR产物的大小约为1049 bp (图1),无杂带、特异性良好,与我们所设计的相吻合,克隆后片段大小与PCR产物大小吻合. 基因重组载体的酶切鉴定用Bam H和EcoR双酶切含有TRAIL基因的pMD18T载体,获得大小为1049 bp的目的片段(图2),表明含有TRAIL基因的克隆载体
8、构建成功. 基因的序列分析以定向克隆入pMD18T载体中的TRAIL基因的PCR产物转化 DH5, 挑取均含有目的基因片段的5个菌落,取其中1个菌落做序列测定证实,所得序列的结果联网到NCBI进行同源性分析. 核酸序列与质粒pMD18TTRAIL中的TRAIL序列同源性为%,发现有两个碱基突变. 在NCBI的ORF finder中, 服务器分析开放阅读框架, 翻译成281个氨基酸序列, 进行同源性分析, 同源性为100%. 说明测序结果中的两个碱基突变为同义突变, 外源TRAIL基因可以正确表达. 3讨论 TRAIL为肿瘤坏死因子(TNF)超家族的新成员. 人的TRAIL基因编码一种Mr 32
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 胎盘 TRAIL 基因 cDNA 克隆 鉴定
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【丰****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【丰****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。