混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义.docx
《混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义.docx(18页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、混合系白血病基因重排的检测方法及其临床意义【摘要】 为了研究混合系白血病基因重排在急性白血病(AL)中的发生率、融合基因类型及其临床意义,用荧光原位杂交技术检测60例急性白血病患者MLL基因重排,对于MLL基因重排阳性的患者,用巢式RTPCR方法检测MLL基因重排形成的6种常见融合基因类型。结果表明: 7例AL患者有MLL基因重排,发生率为%,其中2例为急性髓细胞白血病M5 ,融合基因均为MLLAF9 ;另5例为B细胞系急性淋巴细胞白血病,其中2例融合基因为MLLENL,1例MLLAF4,2例未扩增出融合基因产物。结论:荧光原位杂交技术是检测AL MLL基因易位重排的快速、特异、灵敏的方法,巢
2、式RTPCR是检测MLL基因重排产生的融合基因类型的简便可行的方法;MLL基因重排的检测对急性白血病预后判断和治疗方案的选择具有重要意义。【关键词】 急性白血病 混合系白血病基因 基因重排 荧光原位杂交 巢式RTPCR Detection of Rearrangements of Mixed Lineage Leukemia Gene and Its Clinical Significance Abstract To study the incidence, the types of fusion genes and the clinical significance of rearrange
3、ments of mixed lineage leukemia (MLL) gene in acute leukemia (AL), the rearrangements of MLL gene of 60 patients with AL were detected by fluorescence in situ hybridization (FISH) and 6 types of common fusion genes resulting from the rearrangements of MLL gene were detected by nested RTPCR. The resu
4、lts showed that 7 out of 60 AL patients were found the rearrangements of MLL gene, the incidence of which was %. 2 out of 7 patients were diagnosed as AMLM5, 5 patients were diagnosed as BALL. The fusion genes of the 2 AMLM5 patients who had the rearrangements of MLL gene were MLL/AF9. Among 5 BALL
5、patients, 2 patients were confirmed to express MLL/ENL, 1 patient was confirmed to express MLL/AF4, the other 2 patints did not express the fusion genes. It is concluded that FISH is a fast, specific and sensitive method to detect the rearrangements of MLL gene in AL patients and nested RTPCR is a c
6、onvenient and feasible method to detect the types of fusion genes resulting from the rearrangements of MLL gene. The detection of MLL gene rearrangement is of great importance in predicting prognosis and guiding therapy in AL. Key words acute leukemia; mixed lineage leukemia gene; gene rearrangement
7、;fluorescence in situ hybridization; nested RTPCR 混合系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)基因位于染色体11q23。人类白血病包括初发和治疗相关性白血病,伴有MLL重排。Munoz等1报道,MLL重排阳性患者对常规化疗多不敏感,对大剂量化疗或干细胞移植有效,是预后不良的指标。世界卫生组织提出将其单列为11q23 /MLL白血病2。 因此,MLL基因重排的检测对急性白血病预后判断和治疗方案选择具有重要意义3。我们采用FISH 技术和巢式RTPCR方法对60例AL患者作了初步研究,探讨MLL基因重排在AL中的发生率、产生
8、融合基因的类型及其临床意义。 材料和方法 研究对象 60例 AL 患者为我院血液科和深圳市其他医院血液科2003年9月-2005年12月的住院患者,男28例、女32例,年龄3个月-54岁,其中 15岁者17例,15岁者43例。所有患者的诊断符合FAB诊断标准。60例AL患者中急性淋巴细胞白血病(ALL)30例, AML 28例1例,NK细胞白血病1例。59例为初治患者,1例为难治患者。 细胞处理 对1例难治性AL患者采集肝素抗凝外周血2 ml,其余59例患者均于化疗前采集肝素抗凝骨髓2 ml,接种于培养瓶,经直接法或者经24小时培养,按标准方法制备染色体标本,用已制备好染色体标本的细胞悬液2-
9、3滴滴片,自然凉于后用 mgL蛋白酶K室温消化3分钟,室温条件下在2SSC中洗涤2分钟,并分别于70、85、100 的乙醇中梯度脱水2分钟,凉干。 FISH检测 探针配制 7 l杂交液,再加2 l双蒸水加1 l MLL双色断裂分离重排探针,混匀后加5 l于玻片杂交区内,盖上盖玻片,橡胶水泥封片,于78热平台上变性3分钟后置37湿盒中避光杂交过夜,杂交后去盖玻片,采用快速洗涤法:73含的NP40的SSC(pH )中洗10秒,室温下在含%的NP40的2SSC(pH )中洗5秒,用含二咪基苯基吲哚(DAPI,浓度为 mgL)的抗褪色液复染标本10分钟后用荧光显微镜观察,每例至少分析200个细胞。 F
10、ISH结果判断标准 MLL基因易位重排阴性的细胞显示2个融合信号,MLL基因易位重排阳性的细胞中红色和绿色信号分离,显示1个融合信号和1个红色及1个绿色信号。 MLL融合基因表达的巢式RTPCR检测4 第一轮PCR 引物:均委托上海Sangon公司合成,序列A: MLL 5CCC AAA GAA AAG CAG TAG TGA 3;B: AF4 5TTT GTA GGG AAA GGA AAC TTG 3;C: AF6 5TTC CCG ATC ATC TTT GTT C 3;D: AF9 5GAT TTG CTT TGC TTT ATT G 3;E: AF10 5CTG TTC TAT GC
11、T GGC TGC TA 3;F: AF10 5CTG GTT GAT CAT AGC GAA TC 3;G: ELL 5GCT TCC TTG AAA TCG GAT AG 3;H: ENL 5CGT ACC CCG ACT CCT CTA CT 3;I: ENL 5GCC TGA CAC CTT GCT GTT 3。 RNA提取:用TRIzoL提取细胞总RNA, 紫外分光光度计测定RNA纯度,同时进行RNA定量。 PCR:PCR反应分别在6个体系中进行,体系 1检测MLL/AF4 融合基因,上游引物用A,下游引物用B;体系2检测MLL/AF6 融合基因,上游引物用A,下游引物用C;体系 3
12、检测融合基因MLL/AF10,上游引物用A,下游引物用E和F;体系4检测融合基因MLLENL,上游引物用A,下游引物用H 和I;体系 5检测融合基因MLL/AF9 ,上游引物用A,下游引物用D;体系6检测融合基因MLL/ELL,上游引物用A,下游引物用G。PCR反应体系50 l用一步法RTPCR试剂盒配制,含总RNA1 g,10RTPCR缓冲液5 l,25 mmol/L MgCl2 10 l,10 mmol/L dNTPs 5 l,40 U/l RNA酶抑制剂1 l,5 U/ l AMV逆转录酶1 l,5 U/l AMV Taq DNA多聚酶1l,特异引物各30 pmol,内参照上下游引物各1
13、6 pmol。扩增条件:50 30 分钟 RT反应,94 2分钟,逆转录酶灭活,(94 30秒,5630秒,72 1分钟)共30个循环,72延伸 5分钟。 第2轮PCR 引物序列:J: MLL 5CTC AGC CAC CTA CTA CAG GAC 3;K: AF4 5TTT GGT TTT GGG TTA CAG AAC 3;L: AF6 5GAT AAC CCC TTC TTT TTC CTG 3;M: AF9 5AGC GAG CAA AGA TCA AAA TC 3;N: AF10 5CCT GGA AAT TTG CAT TTG TAA 3;O: AF10 5TCT TCC AAG
14、 CGC TTC AAT 3;P: ELL 5CCG ATG TTG GAG AGG TAG AA 3;Q: ENL 5GGA CAA ACA CCA TCC AGT C 3 ;R: ENL 5GGC GCT GTT GTC ACT CTC 3。内参照2 MG 引物上游:5ACC CCC ACT AAA AAG ATG A 3,下游:5ATC TTC AAA CCT CCT AGA TG 3。 PCR:仍然在6各体系中进行,体系1检测MLL/AF4 融合基因,上游引物用J,下游引物用K;体系2检测MLL/AF6融合基因,上游引物用J,下游引物用L;体系3检测融合基因MLL/AF10 ,上游引物
15、用J,下游引物用N 和O;体系4检测融合基因MLL/ENL,上游引物用J,下游引物用Q和R;体系5检测融合基因MLL/AF9 ,上游引物用J,下游引物用M;体系6 检测融合基因MLL/ELL,上游引物用J,下游引物用P。反应体系50 l含第1轮RTPCR产物1-2 l,10PCR 缓冲液5 l,25 mmol/L MgCl2 4 l,2 mmol/L dNTPs 5 l,2 U/l Taq DNA多聚酶 l,特异引物各30 pmol,内参照上下游引物各16 pmol。扩增条件:94 5分钟,(94 30秒,56 30秒,72 30秒),共30个循环,72延伸5分钟。两轮PCR反应中每个体系均设
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 混合 白血病 基因 重排 检测 方法 及其 临床意义
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【天****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【天****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。