桂枝汤对脾虚大鼠NFAT-mRNA-IL.docx

桂枝汤对脾虚大鼠NFAT mRNA，IL4 mRNA，IFNγ mRNA的干预作用
【摘要】 目的：采用RTPCR 方法 来探讨桂枝汤对脾虚NFAT mRNA，IL4 mRNA，IFNγ mRNA的 影响 以及干预Th1/Th2细胞漂移的机制. 方法：40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、脾虚组(B组)、桂枝汤大剂量组(C组)和桂枝汤小剂量组(D组)等4组，每组10只；用规范的脾气虚证大鼠模型造模方法将B，C和D组大鼠造模，B，C和D组分别用蒸馏水、 桂枝汤大剂量、 桂枝汤小剂量灌胃，标本采集后用RTPCR检测NFAT mRNA， IL4 mRNA和IFNγ mRNA表达水平. 结果：脾虚组的NFAT mRNA，IL4 mRNA表达上调；而IFNγ mRNA表达下调，经桂枝汤大、小剂量组 治疗 后，NFAT mRNA，IL4 mRNA表达下调，IFNγ mRNA表达上调. 结论：桂枝汤对Th1/Th2细胞漂移作用途径可能是通过下调NFAT mRNA的表达，恢复了IFNγ mRNA正常转录水平，进而下调IL4 mRNA的表达，使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的平衡.
【关键词】 桂枝汤；活化T细胞核因子；白细胞介素4；γ干扰素
　　0引言
　表明，在生理条件下，Th1细胞和Th2细胞分泌的两类因子互相调整，相互制约，处于一种动态平衡状态. 一旦两者平衡失调，细胞因子作用于细胞表面相应受体，活化信号转导因子(signal transducer factor, STF)，将刺激信号传至核内而发挥其基因转录的调节作用，使机体局部乃至全身发生病理反应［1］. 我们通过观察脾虚证模型动物Th1细胞、Th2细胞中具有代表性的γ干扰素(interferonγ，IFNγ)、白介素4(interleuin4，IL4)以及T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT) mRNA的表达以及桂枝汤对三者的影响， 探讨脾虚证模型动物与Th1/Th2细胞漂移的关系以及桂枝汤对其的逆转作用.
1材料和方法
材料SD大鼠40只， 清洁级， 雄性，体质量200~300 g，由上海实验动物中心提供. 在江西中医学院动物实验中心清结级25~27℃条件下饲养. SD大鼠在动物房适应性饲养1 wk后，称质量并随机分为空白对照组，脾虚模型组，桂枝汤大剂量组，桂枝汤小剂量组，每组10只. 桂枝汤中桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣购于江西中医学院附属 医院 ，按《伤寒论》原方10∶10∶7∶10∶10配比混合药物(大枣剖开)置于烧杯中. 加入5倍蒸馏水冷浸60 min，快速加热至沸腾，而后保持微沸状态15 min，趁热抽滤，药渣中加入3倍蒸馏水，浸泡30 min，快速加热至沸，微沸10 min，趁热抽滤，弃药渣，合并滤液，水浴浓缩相当于生药1 kg/L的滤液，4℃保存. 主要试剂与仪器有卵清蛋白、刀豆蛋白A，Trizol (GibcoBRL公司)，Rmasin, MMLV，Tag酶，并由上海生工合成引物，DNAmark(北京鼎国生物试剂公司)，PCR仪，紫外分光光度仪，Eagle Eye II成像 分析 系统(美国).
方法
模型建立先按初步规范的脾气虚证大鼠模型造模方法建模［2］. 造模30 d后大鼠表现符合中医学中的脾虚症状.
给药除A组10只大鼠不需造模外， B，C和D组共30只大鼠按 文献 ［2］方法造模30 d. A组大鼠胃饲蒸馏水 mL， 2次/d，连续14 d；成模后B组大鼠灌服蒸馏水 mL， 2次/d，连续14 d；成模后C组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为6 g/kg［3］， 2次/d，连续喂药液14 d；成模后D组大鼠灌服桂枝汤滤液，约为3 g/kg，2次/d，连续喂药液14 d (C，D两组给药剂量按人与动物间体表面积折算).
细胞悬浊液的制备采用常规方法, 大鼠拉颈处死, 无菌条件下剪开腹腔取出脾脏研磨,在100目铜网上轻轻挤压，培养基上培育并制成细胞悬液,用低渗压除去红细胞,以Hanks液洗涤, 配成1×1010/L及2×1010/L脾细胞悬液. 滤过后将收集的脾细胞悬液加到淋巴细胞分离液中，吸出中间灰白色细胞层，用尼龙毛柱T细胞分离法分离T淋巴细胞［4］.
增殖刺激重悬T淋巴细胞， 调整浓度为1×109/L，用台盼蓝染色，活性细胞＞95%，置于24孔培养板中，每孔加细胞悬液1 mL，各组内加入卵清蛋白至终浓度 g/L，刀豆蛋白A 25 mg/L，37℃ 50 mL/L CO2孵箱中孵育24 h.
PCR将收集培养后的细胞调成细胞悬液，用Trzol提取总RNA，紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度，-70℃冻存备用. 用2 μL逆转录试剂盒逆转录合成cDNA， -70℃冻存备用. 用5 μL逆转录产物进行PCR扩增反应，并以βactin为内对照. IL4，IFNγ和NFAT的引物参照报道［5-7］设计，βactin引物参照Genebank中cDNA序列，具体序列及扩增长度见表1. βactin反应条件：94℃ 30 s变性，50℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸；PCR反应条件：94℃ 5 min变性，然后35个循环的扩增，最后延伸72℃ 10 min. IFNγ每一个循环包括94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s；IL4每一循环包括94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，NFATc每一循环包括94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min.表1PCR所有引物及扩增长度
扩增反应半定量分析5 μL PCR产物经15 g/L琼脂糖电泳，溴化乙啶染色，能过像分析读取目的电泳带A值，将目的条带与βactin条带的比值作为目的基因mRNA的表达量，目的基因mRNA的表达量=目的条带A值/βactin条带A值.
学处理：计量资料以x±s表示，组间比较用SPSS软件包进行方差分析及SNKq检验.
　　2结果
实验各组的 NFAT mRNA，IL4 mRNA，IFNγ mRNA的 影响 (表2). B组的NFAT mRNA， IL4 mRNA表达上调；而IFNγ mRNA表达下调，经C组 治疗 后，NFAT mRNA，IL4 mRNA表达下调，IFNγ mRNA表达上调，与正常组相比较，基本恢复了正常水平. IFNγ，IL4，NFAT及βactin的扩增产物经15 g/L琼脂糖电泳，所示条带分别为405,360,392和512 bp，符合设计的片段.表2实验各组NFAT mRNA,IL4 mRNA及IFNγ mRNA的表达
3讨论
1986年Mosman等［6］证实CD4+可以　成功能不同的Th1和Th2亚群，它们各自产生特征性细胞因子. Th1细胞主要分泌干扰素γ(interferonγ,IFNγ), IL2, IL12等多种Th1型细胞因子；Th2细胞分泌的IL4，IL5，IL10等多种Th2型细胞因子. Th1细胞和Th2细胞通过细胞因子的交互调节而互为调节细胞,从而形成复杂的细胞因子　，例如由Th1细胞分泌的IFNγ是Th1细胞分化的重要的细胞因子，它可抑制Th2细胞的分化. IL4和IL10是Th2细胞分化的重要的细胞因子，可抑制Th1细胞的分化［1］.
活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)是一类与众多信号传导途径相，具有广泛生理功能的转录因子［8］. NFAT可以选择性诱导细胞因子和其他免疫调控基因的转录，从而在免疫应答过程中扮演着中心角色［9］.
“脾”的防卫功能与　免疫功能有许多相似之处，脾与免疫功能之间的关系非常密切［10］. 桂枝汤组方多以调补脾胃药为基础，桂枝汤以甘草、大枣、生姜三味药升腾脾胃清阳之气，培中土，滋化源，故可改善脾虚状况，增强人体免疫力. 桂枝汤治疗前，脾虚组的NFAT mRNA，IL4 mRNA表达上调；而IFNγ mRNA表达下调，说明了脾虚大鼠Th1/Th2细胞失去了平衡，Th细胞向Th2细胞分化，Th细胞向Th1分化途径受到抑制，此时，Th2应答占优势. 其机制可能是脾虚大鼠调节因子NFAT表达上调，其通过信号传导途径阻断诱导IFNγ的表达，解除了对IL4表达的竞争抑制作用，从而使IFNγ的表达下调，IL4的表达上调；经桂枝汤大小剂量组治疗后，NFAT mRNA，IL4 mRNA表达下调，IFNγ mRNA表达上调，与正常组相比较，基本恢复了正常水平，说明了桂枝汤可以诱发Th1优势应答，抑制Th2优势应答，最终使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的动态平衡.
【 参考　文献 】
　　［1］ 秦卫兵. Th1和Th2细胞在体内的分化［J］. 国外医学免疫分册，2002，25：42-46.
　　［2］ 周永生,樊雅莉,陈小野,等. 脾气虚证动物模型规范化的初步 研究 -部分免疫功能方面［J］. 实验动物 科学 与, 2003, 20：1-5.
　　［3］ 窦如海.实验动物和动物实验技术［M］.济南:山东科学技术出版社，2006：126.
　　［4］ 王兰兰. 免疫学和免疫检验 ［M］.北京:人民卫生出版社，2004：183.
　　［5］ Adachi S, Amasaki Y, Miyatake AN,et al. Successive expression and activation of NFAT family members during thymocyte differentiation［J］. Biol Chem,2000, 275(19):14708.
　　［6］ Kidd P. Th1/Th2 balance:　The　hypothesis, its limitations, and implications for health and diseases ［J］.Altern Med Rev,2003,8: 223-246.
　　［7］ 魏海明，刘杰，田志刚.检测Th1/Th2亚群的临床意义［J］. 中华检验医学杂志，1998，21(1)：56.
　　［8］ Shew JP. NFAT is responsible for tissuespecific expression［J］.Science, 1988,241:202.
　　［9］ 柴蔚然．活化T细胞核因子的研究进展［J］. 中国 男科学杂志,2006,20(6): 69-72.
　　［10］ 刘永琦.脾虚证的免疫学本质及中医药防治脾虚的免疫机制研究［J］.中国中医药信息杂志，2002,9(10):5.