桂枝汤对脾虚大鼠NFAT-mRNA-IL.docx
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1、桂枝汤对脾虚大鼠NFAT mRNA,IL4 mRNA,IFN mRNA的干预作用【摘要】 目的:采用RTPCR 方法 来探讨桂枝汤对脾虚NFAT mRNA,IL4 mRNA,IFN mRNA的 影响 以及干预Th1/Th2细胞漂移的机制. 方法:40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、脾虚组(B组)、桂枝汤大剂量组(C组)和桂枝汤小剂量组(D组)等4组,每组10只;用规范的脾气虚证大鼠模型造模方法将B,C和D组大鼠造模,B,C和D组分别用蒸馏水、 桂枝汤大剂量、 桂枝汤小剂量灌胃,标本采集后用RTPCR检测NFAT mRNA, IL4 mRNA和IFN mRNA表达水平. 结果:脾虚组的NFAT
2、 mRNA,IL4 mRNA表达上调;而IFN mRNA表达下调,经桂枝汤大、小剂量组 治疗 后,NFAT mRNA,IL4 mRNA表达下调,IFN mRNA表达上调. 结论:桂枝汤对Th1/Th2细胞漂移作用途径可能是通过下调NFAT mRNA的表达,恢复了IFN mRNA正常转录水平,进而下调IL4 mRNA的表达,使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的平衡.【关键词】 桂枝汤;活化T细胞核因子;白细胞介素4;干扰素0引言表明,在生理条件下,Th1细胞和Th2细胞分泌的两类因子互相调整,相互制约,处于一种动态平衡状态. 一旦两者平衡失调,细胞因子作用于细胞表面相应受体,活化信号转导因子
3、(signal transducer factor, STF),将刺激信号传至核内而发挥其基因转录的调节作用,使机体局部乃至全身发生病理反应1. 我们通过观察脾虚证模型动物Th1细胞、Th2细胞中具有代表性的干扰素(interferon,IFN)、白介素4(interleuin4,IL4)以及T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT) mRNA的表达以及桂枝汤对三者的影响, 探讨脾虚证模型动物与Th1/Th2细胞漂移的关系以及桂枝汤对其的逆转作用. 1材料和方法 材料SD大鼠40只, 清洁级, 雄性,体质量200300 g,由上海实验动物
4、中心提供. 在江西中医学院动物实验中心清结级2527条件下饲养. SD大鼠在动物房适应性饲养1 wk后,称质量并随机分为空白对照组,脾虚模型组,桂枝汤大剂量组,桂枝汤小剂量组,每组10只. 桂枝汤中桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣购于江西中医学院附属 医院 ,按伤寒论原方101071010配比混合药物(大枣剖开)置于烧杯中. 加入5倍蒸馏水冷浸60 min,快速加热至沸腾,而后保持微沸状态15 min,趁热抽滤,药渣中加入3倍蒸馏水,浸泡30 min,快速加热至沸,微沸10 min,趁热抽滤,弃药渣,合并滤液,水浴浓缩相当于生药1 kg/L的滤液,4保存. 主要试剂与仪器有卵清蛋白、刀豆蛋白A,T
5、rizol (GibcoBRL公司),Rmasin, MMLV,Tag酶,并由上海生工合成引物,DNAmark(北京鼎国生物试剂公司),PCR仪,紫外分光光度仪,Eagle Eye II成像 分析 系统(美国). 方法 模型建立先按初步规范的脾气虚证大鼠模型造模方法建模2. 造模30 d后大鼠表现符合中医学中的脾虚症状. 给药除A组10只大鼠不需造模外, B,C和D组共30只大鼠按 文献 2方法造模30 d. A组大鼠胃饲蒸馏水 mL, 2次/d,连续14 d;成模后B组大鼠灌服蒸馏水 mL, 2次/d,连续14 d;成模后C组大鼠灌服桂枝汤滤液,约为6 g/kg3, 2次/d,连续喂药液14
6、 d;成模后D组大鼠灌服桂枝汤滤液,约为3 g/kg,2次/d,连续喂药液14 d (C,D两组给药剂量按人与动物间体表面积折算). 细胞悬浊液的制备采用常规方法, 大鼠拉颈处死, 无菌条件下剪开腹腔取出脾脏研磨,在100目铜网上轻轻挤压,培养基上培育并制成细胞悬液,用低渗压除去红细胞,以Hanks液洗涤, 配成11010/L及21010/L脾细胞悬液. 滤过后将收集的脾细胞悬液加到淋巴细胞分离液中,吸出中间灰白色细胞层,用尼龙毛柱T细胞分离法分离T淋巴细胞4. 增殖刺激重悬T淋巴细胞, 调整浓度为1109/L,用台盼蓝染色,活性细胞95%,置于24孔培养板中,每孔加细胞悬液1 mL,各组内加
7、入卵清蛋白至终浓度 g/L,刀豆蛋白A 25 mg/L,37 50 mL/L CO2孵箱中孵育24 h. PCR将收集培养后的细胞调成细胞悬液,用Trzol提取总RNA,紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度,-70冻存备用. 用2 L逆转录试剂盒逆转录合成cDNA, -70冻存备用. 用5 L逆转录产物进行PCR扩增反应,并以actin为内对照. IL4,IFN和NFAT的引物参照报道5-7设计,actin引物参照Genebank中cDNA序列,具体序列及扩增长度见表1. actin反应条件:94 30 s变性,50 30 s退火,72 3 min延伸;PCR反应条件:94 5 m
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