2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究.docx
《2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究.docx(14页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究 作者:柴可夫 黄晓玲 钱俊文 马纲【摘要】 目的从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。方法抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血,检测血糖,血脂及电解质,分离血液中的白细胞,提取总RNA,化学发光方法检测基因芯片,用ScanAlyze软件采集图像,GEArray Analyzer软件分析数据。对部分差异表达基因进行RTPCR和Westernblotting方法验证。结果2型糖尿病湿热困脾证患者血糖,血脂,电解质与健康人有显着差异,基因芯片检测发现和健康人差异表达基因共38条,其中上调的基因有24条,下调的基因有14条。并发现湿热困脾证的特异性基因
2、。通过RTPCR和Westernblotting方法反向验证IRS2和FOXC2基因,证实2型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细胞中存在IRS2和FOXC2存在差异表达。结论应用基因芯片筛选2型糖尿病湿热困脾证的差异表达基因,为2型糖尿病辨证论治提供新思路。【关键词】 2型糖尿病;基因芯片;辨证分型糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的慢性疾病。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低,引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱为主要共同标志。本研究观察糖尿病湿热困脾证的基因表达差异,探讨2型糖尿病湿热困脾证的证候实质。1 临床资料研究对象 对浙江中医药大学附属第二
3、医院糖尿病防治中心400例糖尿病患者进行中医辨证分型,随机选取6例湿热困脾证患者,其中男性3例,女性3例,年龄30岁至65岁之间,年龄岁。另选取年龄与性别相匹配的健康人6例作对照,平均为岁。健康对照组皆通过血糖检查排除糖尿病,通过病史调查和体检、血象、肝肾功能、胸透、心电图等检查,排除其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。2 现代医学诊断标准 根据1999年WHO专家咨询报告诊断标准,空腹血糖/L(126mg/dl);或糖耐量试验中服糖后2小时血糖/L(200mg/dl);或随机血糖/L(200mg/dl)。3 中医辨证标准 参照2002年版中药新药临床研究指导原则中“中药新药治疗糖尿病的临床研究
4、指导原则”,湿热困脾证,主症:胸脘腹胀,或食后饱满,头身困重。次症:体形肥胖,心胸烦躁,四肢倦怠,小便黄赤,大便不爽。舌脉:舌红苔黄腻,脉滑而数。4 病例纳入和排除原则 凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准,可纳入试验病例。排除有糖尿病急性并发症;经确诊为1型糖尿病,其它类型糖尿病及妊娠糖尿病者;年龄在40岁以下或70岁以上,妊娠或哺乳期妇女;有严重心、肝、肾等并发症,或合并有其它严重原发性疾病,精神病患者。中医辨证症状不典型,或者两型三型并见证型复杂者。2 实验方法一般情况 测量身高,体重。计算体重指数/身高。生化检测 所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml,用于测空腹血糖、血脂
5、、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数、血钙、血钾等生化检测。基因芯片检测白细胞的提取与RNA的纯化 随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml,用红细胞裂解液分离白细胞,采用Trizol一步法抽提总RNA,用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度,A260/A280比值在为较纯的RNA,可用于芯片检测。芯片杂交 经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。然后进行化学发光检测的Ampo LabelingLPR标记,变性的c DNA探针全部加入预热的GEAprehyb中,混匀,放在60C待用。弃去杂交管中的GEAprehyb溶液,加入含探针的GEAhyb混合液至
6、杂交管中,60C下6rpm杂交。化学发光检测 洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶,再洗膜4次,加入CDPStar化学发光底物至杂交管中,室温孵育2min。用滤纸去除多余的CDPStar溶液,用X射线胶片曝光。图像采集和数据分析 运行ScanAlyze软件,将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据,使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。逆转录聚合酶链反应方法验证部分差异表达基因。引物设计 将RNA反转录合成CDNA,用Primer5软件设计,由上海生物工程技术有限公司合成。扩增引物PrimerbpIRS2FOXC2actin上游5TTG AGG
7、 CGG CTA AGT CT3下游5TCC CAGgATgCTgTTgC3上游5CCT TCT ACCgCG AGA ACA AG3下游5CCGgGT CGAgCG TCC AGT AG3上游5ATG CCA TCC TGCgTC TG3 下游5ACT CCTgCT TGC TGA TCC3393520566扩增反应条件: FOXC2 945min;9430s;50s;721min; 725min;共30个循环 IRS2 945min;9430s; 50s;721min; 725min;共30个循环 actin 945min;9430s; 50s;721min; 725min;共30个循环
8、扩增产物取10l的actin和10l目的基因在%琼脂糖(含/ml)上电泳,紫外灯下观察结果并照相,吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析,结果为基因表达量对actin内参的比值,以上结果重复3次,取平均值。Westernblotting检测IRS2蛋白的表达 抽提蛋白、制备PAGE胶、膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时。KCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液,将膜置于反应液中室温孵育5min。去除过量的溶液,将膜夹在两塑料薄膜之间,以X光胶片曝光。图片扫
9、描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。统计学分析 各组实验数据以(xs)表示,采用SPSS 软件处理,以One Way ANOVA方法进行方差分析,为统计学意义显着性标准。3 结果糖尿病湿热困脾证临床基本资料间的关系 湿热困脾证组BMI、HbAlc均高于健康对照组,其间差别有统计学意义(),湿热困脾证组ISI显着低于健康对照组()。血脂情况观察发现湿热困脾证的TG水平高于健康对照组;HDLC水平低于健康对照组;LDLC水平明显高于健康对照组,差别有统计学意义。湿热困脾证患者血清钙、血钾均低于健康对照组,见表1、表2、表3。表1 糖尿病湿热困脾证与健康对照组
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 糖尿病 中医 湿热 困脾证 基因 表达 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【快乐****生活】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【快乐****生活】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。