Fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)的工艺研究.docx
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1、Fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)的工艺研究【摘要】 目的: 研究9芴甲氧羰基固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)工艺的步骤及其影响因素. 方法: 采用Fmoc保护氨基,以TBTU/HOBT/DIEA为缩合剂合成MSH. 用色谱仪和质谱仪对合成的多肽进行纯化、鉴定. 结果: 多肽合成的得率可达63%,经反相高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化后可得纯度为%的目标肽. 通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪检测所合成多肽的分子质量为 ku,与其理论分子质量 ku相符. 结论: 该合成法具有快捷、简便、高效地合成多肽MSH的特点,适合大批量生产.【关键词】 固相合成;肽类;MSH;芴
2、甲氧羰基0引言多肽作为生物体内的重要组成部分之一,在体内各脏器中有许多复杂而特殊的生理活性1. 黑色素细胞刺激素(MSH)是由13个氨基酸组成的一种内源性的神经免疫调节肽,可抑制发热与主要类型的实验性炎症. 固相法作为多肽合成领域的一个重大突破在合成多肽MSH中具有快速、简便、高效等优点2,但需要对不参与反应的氨基加以保护,同时氨基酸的侧链上的活性基团也要给予保护. 保护基的选择既要保证侧链基团不参与反应,又要保证在肽链合成过程中不受破坏,同时还要保证在最后肽链裂解时能被除去3. 国内外经常采用叔甲氧基保护氨基,却难以合成对酸不稳定的多肽. 由于本次合成的多肽MSH中含有色氨酸,对酸不稳定.
3、我们旨在采用9芴甲氧羰基基团保护氨基以合成MSH.1材料和方法1材料RPHPLC型高效液相色谱仪(Beckman公司);基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪;台式离心机;台式冻干机;Fmoc保护的氨基酸;1羟基苯并三氮唑,1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐;二异丙基乙胺,三氟乙酸;乙腈;NN二甲基甲酰胺,二氯甲烷,异丙醇,FmocRink AmideMBHA Resin吉尔生化有限公司.方法树脂的选择根据导入反应基团的不同,可以把树脂分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或烯肼型树脂等4. 本次Fmoc固相合成的MSH的末端需要酰氨化,故需要选用一种Rink氨基树脂即Rink AmideMBHA
4、Resin,在Rink Amide MBHA Resin中加入缩合剂TBTU/HOBT/DIEA使MSH的Val与树脂之间形成酰胺键,以此来完成氨基酸的固定.与FmocRink AmideMBHA Resin的连接根据合成多肽的序列,将Rink AmideMBHA Resin置于已用DCM浸泡过的反应器中,加入DMF浸泡30 min左右,使其充分膨胀,然后用含200 mL/L哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团,再用异丙醇洗涤树脂2次,最后用DMF洗涤树脂3次,当用50 g/L茚三酮检测呈阳性时将FmocValOH, TBTU, HOBT, DIEA及DMF配成的反应液加入到树脂中,室温下
5、反应 h,当用茚三酮检验呈阴性时再用异丙醇、DMF溶液各洗涤2次. 即完成第1个氨基酸与树脂的连接.接肽反应选用的接肽反应缩合剂为具有缩合效率高、反应速度快、不易发生消旋化反应的TBTU/ HOBT/DIEA的混合液5,反应时间约为 h,每次反应后取少量树脂用茚三酮法检测,若呈阳性说明反应不完全,继续加入缩合剂,使其充分反应. 若呈阴性说明反应完全,用含200 mL/L哌啶的DMF溶液脱除新接入氨基酸的Fmoc基团以便于下一个氨基酸的羧基反应. 重复此过程至MSH中所有氨基酸全部接入.树脂的切割MSH合成完毕后,用N2吹干MSH树脂,将其置于反应器中,加入切割试剂,室温下磁力搅拌反应3 h左右
6、,使MSH与树脂分离,再经砂芯过滤,将滤液加入冰乙醚中析出多肽,最后经离心分离获得MSH粗品.的纯化和质谱鉴定多肽合成过程中的各种副反应、消旋化以及脱保护的过程中由于保护基的残留、肽键的断裂、烷基化等原因会造成产品不纯. 根据目的肽的要求可采用适当的方法进行纯化. 我们选用的是具有快速、高效和较高回收率等特点的RPHPLC进行纯化6,采用MALDIMS鉴定所得产品.2结果氨基保护基团的选择及其脱除绘制Fmoc基团的脱除效果与哌啶的含量及其脱除时间关系曲线,可以看出随着哌啶含量的增加,脱除反应速度在加快,本次合成选用含200 mL/L哌啶的DMF溶液反应25 min,脱除率在99%以上,可以很好
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