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Fmoc固相合成法合成黑色素细胞刺激素（MSH）的工艺研究
【摘要】 目的： 研究9芴甲氧羰基固相合成法合成黑色素细胞刺激素(MSH)工艺的步骤及其影响因素. 方法： 采用Fmoc保护α氨基，以TBTU/HOBT/DIEA为缩合剂合成MSH. 用色谱仪和质谱仪对合成的多肽进行纯化、鉴定. 结果： 多肽合成的得率可达63%，经反相高效液相色谱仪对合成的多肽进行纯化后可得纯度为%的目标肽. 通过基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪检测所合成多肽的分子质量为 ku，与其理论分子质量 ku相符. 结论： 该合成法具有快捷、简便、高效地合成多肽MSH的特点，适合大批量生产.

　　【关键词】 固相合成；肽类；MSH；芴甲氧羰基
　　0引言
　　多肽作为生物体内的重要组成部分之一，在体内各脏器中有许多复杂而特殊的生理活性［1］. 黑色素细胞刺激素(MSH)是由13个氨基酸组成的一种内源性的神经免疫调节肽，可抑制发热与主要类型的实验性炎症. 固相法作为多肽合成领域的一个重大突破在合成多肽MSH中具有快速、简便、高效等优点［2］，但需要对不参与反应的氨基加以保护，同时氨基酸的侧链上的活性基团也要给予保护. 保护基的选择既要保证侧链基团不参与反应，又要保证在肽链合成过程中不受破坏，同时还要保证在最后肽链裂解时能被除去［3］. 国内外经常采用叔甲氧基保护α氨基，却难以合成对酸不稳定的多肽. 由于本次合成的多肽MSH中含有色氨酸，对酸不稳定. 我们旨在采用9芴甲氧羰基基团保护α氨基以合成MSH.
　　1材料和方法1材料RPHPLC型高效液相色谱仪(Beckman公司);基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪；台式离心机；台式冻干机；Fmoc保护的氨基酸；1羟基苯并三氮唑，1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐；二异丙基乙胺，三氟乙酸；乙腈；NN二甲基甲酰胺，二氯甲烷，异丙醇，FmocRink AmideMBHA Resin［吉尔生化有限公司］.

　　方法树脂的选择根据导入反应基团的不同，可以把树脂分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或烯肼型树脂等［4］. 本次Fmoc固相合成的MSH的末端需要酰氨化,故需要选用一种Rink氨基树脂即Rink AmideMBHA Resin，在Rink Amide MBHA Resin中加入缩合剂TBTU/HOBT/DIEA使MSH的Val与树脂之间形成酰胺键，以此来完成氨基酸的固定.

　　与FmocRink AmideMBHA Resin的连接根据合成多肽的序列，将Rink AmideMBHA Resin置于已用DCM浸泡过的反应器中，加入DMF浸泡30 min左右，使其充分膨胀，然后用含200 mL/L哌啶的DMF溶液脱除树脂上的Fmoc基团，再用异丙醇洗涤树脂2次，最后用DMF洗涤树脂3次，当用50 g/L茚三酮检测呈阳性时将FmocValOH， TBTU， HOBT, DIEA及DMF配成的反应液加入到树脂中，室温下反应 h，当用茚三酮检验呈阴性时再用异丙醇、DMF溶液各洗涤2次. 即完成第1个氨基酸与树脂的连接.

　　接肽反应选用的接肽反应缩合剂为具有缩合效率高、反应速度快、不易发生消旋化反应的TBTU/ HOBT/DIEA的混合液［5］,反应时间约为 h，每次反应后取少量树脂用茚三酮法检测，若呈阳性说明反应不完全，继续加入缩合剂，使其充分反应. 若呈阴性说明反应完全，用含200 mL/L哌啶的DMF溶液脱除新接入氨基酸的Fmoc基团以便于下一个氨基酸的羧基反应. 重复此过程至MSH中所有氨基酸全部接入.

　　－树脂的切割MSH合成完毕后，用N2吹干MSH树脂，将其置于反应器中，加入切割试剂，室温下磁力搅拌反应3 h左右，使MSH与树脂分离，再经砂芯过滤，将滤液加入冰乙醚中析出多肽，最后经离心分离获得MSH粗品.

　　的纯化和质谱鉴定多肽合成过程中的各种副反应、消旋化以及脱保护的过程中由于保护基的残留、肽键的断裂、烷基化等原因会造成产品不纯. 根据目的肽的要求可采用适当的方法进行纯化. 我们选用的是具有快速、高效和较高回收率等特点的RPHPLC进行纯化［6］，采用MALDIMS鉴定所得产品.
　　2结果
　　а氨基保护基团的选择及其脱除绘制Fmoc基团的脱除效果与哌啶的含量及其脱除时间关系曲线，可以看出随着哌啶含量的增加，脱除反应速度在加快，本次合成选用含200 mL/L哌啶的DMF溶液反应25 min，脱除率在99%以上，可以很好的脱除Fmoc保护基团.
　　图19芴甲氧羰基的脱除率与哌啶含量及脱除时间的关系
　　粗品的分析图色谱图中峰数较多，利用色谱工作站软件可知，合成的多肽粗品中，主峰物质占68%.
　　PRHPLC色谱条件：　mm×25 cm(c18,反相)； 流动相中A液: 1 mL/L三氟乙酸的纯水溶液，B液: 1 mL/L三氟乙酸的乙腈溶液；梯度洗脱方式: 900 mL/L A液+100 mL/L B液在30 min内降为100 mL/L A液+900 mL/L B液， 流速: 1 mL/min； 检测波长: 215 nm.
　　图2MSH粗品的色谱图

　　粗品的质谱检测MSH粗品的质谱分析结果显示，质谱图中主峰显示的分子质量为 ku，与MSH的理论分子质量 ku接近，说明MSH粗品中含有MSH(图3).
　　图3MSH粗品的质谱图
　　的纯化及纯化后的色谱分析在RPHPLC纯化过程中选用的离子对为三氟乙酸. 从多肽MSH纯化后的色谱分析结果可以看出，主峰面积较大，其他峰面积与主峰相比较小，表明合成的粗品经RPHPLC纯化后可能会得到较纯的MSH.
　　纯化后的质谱鉴定MALDIMS分析的结果显示，实际合成的多肽分子质量为 ku，与MSH的理论分子质量 ku相差无几. 同时也可以看出，图中峰数很少，而且主峰明显，说明本次合成的MSH经色谱仪纯化后，可以除去大部分的杂质，从而得到较纯的MSH.
　　PRHPLC色谱条件：　mm×25 cm(c18,反相)； 流动相中A液: 1 mL/L三氟乙酸的纯水溶液，B液: 1 mL/L三氟乙酸的乙腈溶液；梯度洗脱方式: 900 mL/L A液+100 mL/L B液，在30 min内降为100 mL/L A液+900 mL/L B液； 流速: 1 mL/min; 检测波长: 215 nm.
　　图4MSH纯化后的色谱图
　　图5MSH纯化后的质谱图
　　3讨论
　　用于合成多肽的树脂具有多种类型，实际合成中要根据合成多肽的特点，选择合适的树脂作为载体,由于MSH的末端需要酰氨化,所以选用Rink AmideMB
　　HA Resin,这种树脂具有稳定的理化性质、足够多的反应位点及副反应少等优点，可以提高产物得率，降低纯化成本.

　　固相合成通常采用Boc和Fmoc两种策略对α氨基加以保护［7］,与Boc法相比，Fmoc法更适合合成对酸不稳定的多肽, 而且具有反应条件温和、副反应少、可以大量合成等优点. 由于本次合成的多肽MSH，其中含有的色氨酸对酸不稳定，所以要选择Fmoc基团对α氨基进行保护.

　　DCC是多肽合成中常用的一种缩合试剂，但它往往会伴随一些副反应，这样会降低产物得率，提高纯化成本. TBTU/ HOBT/DIEA作为新型的复合型缩合试剂，是减少在肽链延伸过程中这些副反应产生的有效方法，同时也具有反应快速，缩合条件温和以及产物易于纯化等特点，所以可以达到提高产物得率，降低纯化费用的目的，便于多肽MSH的产业化生产［8］.

　　合成多肽MSH时，在每一步反应完成后，下一个氨基酸接入之前，需要脱除Fmoc基团，通常采用哌啶的DMF溶液，其脱除效果与哌啶含量有关，200 mL/L哌啶的DMF溶液与100 mL/L哌啶的DMF溶液相比，脱除时间较短，脱除效果却更好，但当哌啶含量过大时，就会因反应过于剧烈而出现副反应，这样不利于脱除后的洗涤. 所以我们采用的是200 mL/L的DMF溶液.

　　Fmoc固相法合成多肽MSH，首先采用RPHPLC对粗品进行分析，确定粗品分析图中主峰物质的含量并将其作为样品进行质谱分析，再采用RPHPLC对其进行纯化，可以得到%的高纯度产物，最后经MALDIMS鉴定，主峰显示的分子质量为 ku，与MSH的理论分子质量 ku接近. 由于采用Fmoc基团保护а氨基，选用TBTU/HOBT/DIEA作为缩合剂，可以有效的提高MSH的合成效率. 因此，采用本合成工艺合成多肽MSH具有反应条件温和，缩合效率高以及合成成本低的特点，适合于大规模生产.
　　【参考文献】
　　［1］ 杨凌春，郭雪峰, 齐传民，等. 小分子多肽合成方法的改进［J］. 北京师范大学学报，2003, 39(1)：97.
　　［2］ 韩香，顾军. 固相法在多肽合成领域的应用［J］. 药学进展，2002,28(1):10.
　　［3］ Ramage R, Jiang L, Kim YD, et al. Comparative studies of Nsc and Fmoc as N(alpha)protecting groups for SPPS［J］. Pept Sci, 1999,5(4):195-200.
　　［4］ Zikos C. comparative evaluation of four trityltype amidomethy polystyrene resins in Fmoc solid phase peptide synthesis［J］. Pept sci, 2003,9(7):419-429.
　　［5］ Li P, Xu JC. Studies of Novel and Highly Efficient Peptide Coupling Pegents［J］. J Graduat School Chin Acad Sci, 2004,21(1):125.
　　［6］ 师治贤，王俊德. 生物大分子的液相色谱分离和制备［M］. 2版. 北京: 科学出版社,1996:73-200.
　　［7］ 陶慰孙，李维，姜涌明. 蛋白质分子基础［M］. 2版. 北京：高等教育出版社，1995: 175-180.
　　［8］ 李根, 李崇熙, 邢其毅,等. 多肽合成中羧基活化方法的一些新进展［J］. 有机化学，1989, 9(5): 396-401.