四君子汤通过miR-375...小鼠肝脏脂质沉积的分子机制_杨莹.pdf

收稿日期：；修订日期：基金项目：辽宁省自然科学基金（）；辽宁省“百千万人才工程”资助项目 类项目作者简介：杨 莹（），女（满族），辽宁营口人，辽宁中医药大学在读硕士研究生，主要从事中西医结合基础研究工作通讯作者简介：孙广江（），男（汉族），辽宁营口人，辽宁中医药大学附属医院副主任医师，硕士学位，主要从事骨质疏松症及与其他疾病关系相关基础研究与治疗工作通讯作者简介：裴宇鹏（），男（汉族），辽宁阜新人，辽宁中医药大学高级实验师，硕士学位，主要从事中西医结合临床工作四君子汤通过 途径改善 动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质沉积的分子机制杨 莹，王 群，王 莹，宋 囡，杨 潇，刘子玉，孙广江，裴宇鹏（辽宁中医药大学，辽宁 沈阳；辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳；辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳）摘要：目的 观察四君子汤通过调节铁死亡途径对 动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质沉积的影响。方法 小鼠 只饲喂高脂饲料 周，随机分为模型组和四君子汤组，四君子组给予四君子汤（）灌胃，连续 周；另选 只 小鼠作为正常组；全自动生化分析仪检测血清甘油三酯（）、总胆固醇（）、高密度脂蛋白胆固醇（）和低密度脂蛋白胆固醇（）的含量；和油红 染色观察肝脏组织病理变化；法检测 及 水平；全自动蛋白质印迹定量分析系统检测（）及 蛋白表达；法检测 （）及 表达。结果 四君子汤能降低动脉粥样硬化小鼠血清、和 含量，提升 含量；抑制 水平，提高 水平；铁死亡相关蛋白检测结果显示四君子汤可以使动脉粥样硬化小鼠、蛋白水平显著升高；结果显示四君子汤组小鼠肝脏、表达上升（，），表达显著下降（）。结论 四君子汤能够改善 小鼠肝脏脂质沉积，可能与干预肝细胞铁死亡相关蛋白作用有关。关键词：四君子汤；铁死亡途径；肝脏脂质沉积 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）动脉粥样硬化（，）是全世界心脑血管疾病发生发展的主要原因，。目前由于中药多成分、多途径、多靶点、副作用小的独特优势，其临床防治 备受青睐。因此，寻找更为安全有效防治 的中药复方并深入探讨相关机制具有重要的现实及临床意义。在中医上属于“脉痹”“脉痈”范畴，其病位在血脉，属本虚标实，可诱发“胸痹”“中风”等病证。引发 的因素很多，包括禀赋不足、饮食不节，情志失调，外邪侵袭等因素，医宗必读云：“脾土虚弱，清者难升，浊者难降，留中滞膈，瘀而成痰”。脾失运化，浊邪内生，充斥脉道，日久成痰化瘀，是 发生发展的病机演变过程。可见，以虚实夹杂、本虚标实为病，以脾虚为本，以痰浊及血瘀等邪实为主。那么，治病求本，四君子汤是益气健脾代表方剂，课题组前期研究发现四君子汤改善 小鼠肝脏脂质沉积，进而防治 与抑制肝脏铁死亡途径相关、蛋白及 有关。铁死亡是一种铁依赖的氧化性细胞死亡，其特征是细胞内铁的增加和抗氧化能力的降低导致过氧化脂质的致死性积累。人类基因组计划发现人的基因组中有超过 的序列能被转录成为，但并不能编码蛋白质，被称为非编码 （）。这些非编码 曾被认为是 和蛋白质之间的“过渡”，是“垃圾”，然而目前认为非编码 在各种生物学过程起重要作用。微小（，）是非编码 的一种，它的存在具有广泛性和多样性，在众多疾病中都发挥了重要的作用。成熟的 形成 沉默复合物后，链上的核苷酸序列可以与 的 序列特异性结合，与 结合后，可以降解或抑制，从而沉默靶基因的表达。研究发现 最早是在小鼠胰腺细胞株中被发现，曾被认为是胰腺特异性的，可以调控 胰岛细胞脂性凋亡。但随后被发现在多种肿瘤组织中表达有所变化而发挥调控作用，并且发现其 通过 发挥作用，影响口腔癌细胞的增殖、侵袭、凋亡和细胞周期改变。的表达又是激活铁死亡影响疾病的重要环节。那么，在前期研究的基础上，四君子汤是否可能通过影响 与 介导铁死亡改善肝脏脂质沉积防治，为本文的研究重点。材料与仪器 动动物物 只健康雄性小鼠，周龄，体重（），载脂蛋白 基因敲除（）小鼠，品系小鼠，小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：（京）。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，级，自由饮食饮水，环境温度为（），湿度 。药药物物、试试剂剂与与仪仪器器 四君子汤（）；总胆固醇（，）、甘油三酯（，）、低密度脂蛋白胆固醇（，）、高密度脂蛋白胆固醇（，）测定试剂盒（上海科华生物技术有限公司）；试剂盒购自；还原型谷胱甘肽（），购自南京建成生物工程研究所有限公司；、购于 公司，一抗稀释液（上海碧云天生物技术研究所）；化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；全自动生化分析仪（日本日立 型）；苏木精 伊红（）染色液购自碧云天生物技术有限公司。方法时珍国医国药 年第 卷第 期 模模型型制制备备、分分组组及及干干预预 将 只 小鼠随机分为模型组、四君子组，每组 只。另选 只 小鼠作为正常组。正常组每日给予基础饲料。动脉粥样硬化模型制备采用 小鼠给予高脂饲料喂饲，每日给予高脂饲料（含 胆固醇、脂肪）喂饲 周。造模 周后灌胃给药，给药剂量按人与动物体表面积折算系数进行换算，四君子组以及阳性对照组分别给予四君子汤（）灌胃 周，正常组与模型组给予等体积生理盐水灌胃 周。血血脂脂检检测测 取材前 内小鼠禁食不禁水，取材当天称重，水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，室温静置后，离心，保存待用。全自动生化分析仪检测小鼠血清中、含量。染染色色观观察察肝肝脏脏组组织织病病理理形形态态 将小鼠肝脏组织固定在多聚甲醛 ，按苏木素 伊红（）染色常规方法进行，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（切片厚度 ）、贴片及烤片后，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精染色，盐酸乙醇分色，伊红复染，再用 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，石蜡包埋，光学显微镜下观察小鼠肝脏组织形态。各各组组小小鼠鼠 、水水平平含含量量的的检检测测 血清取材方法同上。按试剂盒说明书操作，检测血清中 含量和 水平表达。全全自自动动蛋蛋白白质质印印迹迹定定量量分分析析系系统统检检测测 （）及及 蛋蛋白白表表达达 不同样品上样量均为 ，包括 ，待检样品与 合为 ，变性。样品准备完全，按照样品、封闭液、一抗、二抗、发光液及清洗缓冲液的顺序分别加入板内，机器自检后先后分别放入毛细管芯及板子，设定板子布局，开始检测，完成检测，进行结果分析。法法检检测测 （）及及 表表达达水水平平 称取 小鼠肝脏组织，严格按照 试剂说明书裂解组织提取总，测定浓度，将样本总 浓度稀释为 后反转录为，加入扩增反应体系运用实时荧光定量 法，个循环结后采用 法进行相对定量分析，检测基因 相对表达水平。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，序列见表。表 引物序列表 统统计计学学处处理理 实验数据均为计量资料数据，采用 软件进行统计分析，用?表示多组之间比较采用单因素方差分析，以 为差异代表在统计学有意义。结果 四四君君子子汤汤对对各各组组小小鼠鼠血血脂脂水水平平的的影影响响 与正常组相比，模型组小鼠血清中、水平含量显著升高，水平显著降低（）；与模型组相比，四君子汤组可以使模型组血清中、水平显著性降低（），同时四君子汤组血清中 水平显著升高（）。见表。表 各组小鼠血清、含量的比较（?）组别 正常组 模型组 四君子汤组 与正常组比较，；与模型组比较，；四四君君子子汤汤对对 小小鼠鼠肝肝脏脏组组织织病病理理形形态态学学影影响响 正常组肝小叶结构正常，肝细胞为圆形且形态饱满，细胞核位置居中，细胞浆内未见明显脂滴，呈条索状排列且肝窦不狭窄；模型组肝细胞体积变大，胞浆内可见大量的脂肪空泡，且大小不等，肝窦狭窄或消失。四君子汤组脂滴明显减少，其病理改变较模型组明显减轻，肝细胞脂肪变性程度减轻，脂肪空泡明显减少，肝窦狭窄有所减轻。可见到正常的肝细胞，肝窦狭窄程度有所恢复。见图。为石蜡切片 染色；为油红 染色图 小鼠肝脏病理形态学观察 各各组组小小鼠鼠血血清清 及及 含含量量变变化化情情况况 各组小鼠 及 水平检测结果发现：与正常组相比，模型组 含量增高（），含量显著降低（）；与模型组相比，四君子汤组中 降低（），含量显著升高（）。见表。四四君君子子汤汤对对 小小鼠鼠肝肝组组织织 （）及及 蛋蛋白白表表达达的的影影响响 与正常组相比，模型 小鼠肝脏 蛋白表达呈现下降趋势，蛋白表达均呈上升趋势，且均具有统计学意义（，）；与模型组相比，四君子汤组肝脏 蛋白表达呈现上升趋势，蛋白表达均呈下降趋势（）。见图。表 各组小鼠血清 及 的变化（?）组别 （）正常组 模型组 四君子汤组 与正常组比较，；与模型组比较，与正常组比较，；与模型组比较，图 各组小鼠肝组织（）及 蛋白表达 时珍国医国药 年第 卷第 期 各各小小鼠鼠肝肝组组织织 （）及及 表表达达的的结结果果 与正常组比较，模型组小鼠肝脏组织、表达显著下降（），表达显著上升（）；与模型组相比，四君子汤组小鼠肝脏、表达上升（，），表达显著下降（）。见表。表 各组小鼠肝脏 表达水平组别 正常组 模型组 四君子汤组 与正常组比较，；与模型组比较，讨论 属于本虚标实之病，脾失健运，痰瘀互结是其主要中医病机。四君子汤为经典健脾益气之方，由人参、白术、茯苓、甘草组成，人参属君药，可健脾养胃、补脾益肺、安神益智；白术为臣药，具有补脾益胃、安胎、健脾和胃、燥湿利水等功效；方中的茯苓属于佐药，利水渗湿，健脾宁心；炙甘草味甘、性平，属于使药，能够调和诸药，诸药联用凸显健脾益气之功效，进而化痰祛瘀，对 的防治可发挥关键作用。目前该方应用与心血管疾病密切相关，。课题组前期研究四君子汤可以通过影响线粒体能量代谢及铁死亡相关蛋白进而防治，。那么，在前期研究的基础上，四君子汤是否可能通过影响 与 介导铁死亡改善肝脏脂质沉积防治，为本文的研究重点。是编码胱氨酸 谷氨酸转运蛋白 功能亚基的基因，在第 号染色体长臂 区 带至 区 带（）上，是溶质转运第 家族的成员。可以特异性转运胱氨酸和谷氨酸，可将细胞膜外的胱氨酸转运到细胞膜内，同时将谷氨酸按照：的比率转运出细胞外。由于，胱氨酸是细胞内合成谷胱甘肽（）必不可少的原料。因此，对维持细胞内 的水平起着重要的作用，是细胞内重要的抗氧化剂，当 发生突变，代谢会发生紊乱，促进铁死亡的发生。有研究发现，在高脂饮食喂养的 小鼠 模型的肝细胞损伤过程中有铁死亡发生。铁死亡参与高脂饮食诱导的 小鼠 的形成，且 诱导的 巨噬细胞来源泡沫细胞中脂质过氧化和铁死亡发生增加，也提示了泡沫细胞铁死亡可能与 的形成有关。本文研究发现四君子汤在改善 小鼠 肝脏脂质沉积的同时，干预铁死亡过程相关蛋白及基因改变。但其上游 是否可能启动铁死亡，我们继续探究 表达情况。（又称 或微小），是体内一类非编码的，长度约为 个核苷酸，其在细胞内具有多种重要的调节作用。它与特异的 结合，调节 的翻译过程，从而调控基因表达。目前推测 可调节人类三分之一基因。近年来大量 及其功能不断被发现，使 已成为当今生命科学研究的热点。其必须通过其调节的，影响这些 的蛋白表达才能发挥作用。是近年来发现的一种微小，最开始是在胰腺中发现，它的表达对胰腺的形态、发存和功能起着至关重要的作用。研究表明胃癌中 通过靶向调控 起抑癌基因的作用，而在肝癌中 通过调控 表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移，还有文献报道 是 的靶基因之一，可影响食管癌细胞的生物学功能。近期研究发现 可通过 发挥作用，影响口腔癌细胞的增殖、侵袭、凋亡和细胞周期改变，说明 是 的靶基因。本研究发现四君子汤可以通过调节 影响（）的表达，干预铁死亡过程相关蛋白及基因，改善 小鼠 肝脏脂质沉积，最终达到防治动脉粥样硬化的目的。参考文献：，：，（）：，（）：甄毕贤，贾连群，杨关林 四君子汤治疗脾气虚证大鼠的血清代谢物谱群特征研究 中华中医药杂志，（）：王 杰，贾连群，宋 囡，等 四君子汤通过铁死亡途径改善动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质沉积 解剖科学进展，（）：刘 洋，孙 岳，杨安宁，等 铁死亡参与高脂饮食诱导的 小鼠动脉粥样硬化及 诱导的泡沫细胞形成过程 实用医学杂志，（）：，（）：郭新华，郑 洋，王佳慧，等 基于 介导的 炎症小体活化探讨中医药在肝纤维化发生中作用的研究进展 中国中药杂志，（）：，（）：许雪娟，李 焱，刘珊英，等 微小 调控 胰岛细胞脂性凋亡 中华糖尿病杂志，（）：吴亚东 调节口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的研究 南方医科大学博士学位论文，张天雪，张 蕾，郝颖香，等 在右美托咪定预处理减轻小鼠肠缺血再灌注损伤引起铁死亡中的保护作用 中国临床药理学与治疗学，（）：石 洪，熊尚全，段晓巧，等 四君子汤合丹参饮加味联合体外反搏治疗气虚血瘀型稳定性冠心病的疗效观察 中国老年保健医学，（）：刘聪聪 四君子汤合丹参饮治疗射血分数正常心力衰竭（气虚血瘀型）的临床研究 山西中医药大学硕士学位论文，王 莹，宋 囡，冷 雪，等 四君子汤对高脂诱导 小鼠致动脉粥样硬化主动脉线粒体能量代谢的影响 中华中医药学刊，（）：，：，（）吴 瑶，宋 囡，贾连群，等 丹参酮 对 小鼠肝脏脂质沉积及铁死亡相关蛋白表达的影响 中国病理生理杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：时珍国医国药 年第 卷第 期