λ-卡拉胶有限水解物在蛋白质置换层析分离中的应用研究.pdf
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1、离子变捷与吸附,2 0 0 2,1 8(2):1 3 8、】4 3I O NE X C H A N G l 5A N DA D S O R P T I O N文章编号1 0 0 1-5 4 9 3(2 0 0 2)0 2 0 13 8 0 6九一卡拉胶有限水解物在蛋白质置换层析分离中的应用研究+杜宗军2 陈冠军p 高培基。1 山东大学微生物技术国家重点实验室,济南2 5 0 1 0 02 青岛海洋大学海洋生命学院,青岛2 6 6 0 0 3摘要:k 卡拉胶经过有限酸水解得到不同平均分子量的组分,连用平均分子量为2 1k D a 的蛆分,作为蛋白质置换层析的王捷荆,用于纤维素酶的分离姥化经过五换
2、层析,使黑色葡萄状犍霉$6 0 7 发酵液中难以通过常规的分子裤和离子交换层折分离的一个内切酶组奇E G 1 1l 和一个B 葡萄糖苷酶组分得到较好的分离关键词:置换层析置换荆b 卡拉胶圩堆素酶中图分类号:0 6 5 2 6史献标识码:A1 前言置换层析是一种多组分制备性层析分离技术,属非线性层析技术之一【1 1 随着H P L C技术的发展和商效传质作用的吸附剂的出现,置换层析技术更加受到科学家们的关注。由于置换层析具有高上样量,高分辨率,高产率及样品浓缩效应等优点,许多学者认为置换层折将成为生物工程下游中用于蛋白质等生物物质分离纯化的最有潜力的技术之一。寻找价廉而无毒的蛋白质的置换剂是蛋白
3、质置换层析研究的重要内容卡拉胶是从红海藻门的角叉菜属及杉菜属等海藻中提取得到的一种带负电荷的强电解质多糖,广泛应用于食品工业中口J。天然卡拉胶是一种太分子量多糖其溶液粘性很大,在稀酸条件下,卡拉胶多糖中的糖苷键可以发生随机的水解,通过控制水解时间,可以得到不同平均分子量的卡拉胶的有限水解物。C h e n 和S c o u t e n p a l 采用酸水解法伟4 得了分子量较低的x 卡拉胶有限水解物,并用这种水解物作为蛋白质离子交换置换层析的置换剂,在常规实验室条件下对模拟混合蛋白进行了分离,取得了较好的效果。在以上工作的基础上我们用k 卡拉胶进行酸水解制备得到了不同平均分子量的组分。然后选
4、用2 1 k D a 分子量的水解物用于天然混合蛋白一黑色葡萄状穗霉纤维素酶的分离工作。使利用常规层析手段难以分离的一个内切酶和一个B 葡萄糖苷酶组分在本实验中得到了较好的分离。收稿日期:2 0 0 2 年1 月6 日项目基金:山东省自然科学基金(r 2 0 0 t i】o,t 1作者简介杜宗军男(i 9 7 4 一),山京省人,硕士讲师通讯联系,E-m a i l:g u a 脚帅 s d uc d uc n 万方数据第1 8 卷第2 期离子交换与吸附-3 9 2 材料和方法2 1 待分离的天然混台蛋白质溶液黑色葡萄状穗霉$6 0 7 培养液,黑色葡萄状穗霉$6 0 7 为本实验室分离保存菌
5、种p 1。2 2 主要试剂S e p h a d e xG 1 0 0、D E A E-S e p h a r o s ef a s tf l o w、C M-S e p h a l o s ef a s tf l o w、Q-S e p h a r o s ef a s tf l o w、标准分子量蛋白为P h a r m a c i a 产品,x 一卡拉胶为S i g m a 公司产品,其它试剂均为国产分析纯。2 3 酶活力测定1 6 12 3 1内切纤维素酶(C M C a s e)活力测定O 5 m l 适当稀释的酶液加上1 5 m l 用拧檬酸缓冲液(p H7 O)配制的1 的羧甲基
6、纤维紊钠溶液,5 0 保温3 0 m i n。2 3 2B 一葡萄糖苷酶(D4 3)活力测定O 5 m l 适当稀释的酶液加上1 5 m l 用柠檬酸缓冲液(p H7 D)配制的J 的水杨营溶液,5 0 保温3 0 m i n。在上述酶活测定中,均用D N S 法测定还原糖(H 葡萄糖作标准)酶活单位采用国际单位(几1):即每毫升酶液每分钟产生一个微摩尔葡萄糖的酶量作为一个酶活力单位。2 4不同分子量k 卡拉胶的制备配制4 的k 卡拉胶溶液,6 0 C 水浴预热。加入等体积的已预热的I m o l LH C I,立即搅匀。水解一定时间后。加入1 0 m o l LN a O H 中和至中性。冷
7、却,加入乙醇至终浓度为6 0,使卡拉胶沉降7 0 C 烘干备用。2 5 卡拉胶平均分子量的测定f w】配制一定浓度的卡拉胶以苯酚-硫酸法测定总糖含量采用S o m o g y i 法测定还原末端的含量,据此推算出k 卡拉胶的平均分子量。2 6 置换层析技术用于纤维素酶的分离纯化2 6 1 粗酶液制备黑色葡萄状穗霉(S t a c h y b o t r y sa t r a)S 6 0 7 发酵液经4 0 0 0 r l m i n 离心l O m i n,去除沉淀后,上清液用截留分子量为5 0 0 0 D a 的滤膜超滤,留取截留液。万方数据2 6 2S e p h a d e xG 1 0
8、 0 凝胶过滤层析浓缩酶液用5 0 m m o l L、p H6 5 的N a 2 H P 0 4-柠檬酸缓冲液超滤、平衡上S e p h a d e xG 1 0 0(16 1 0 0 c m)层析柱,合并收集含有内切酶活力及B 葡萄糖菅酶活力的部分。2,6,3C M,S e 曲a r o s e f a s t f l o w 阳离子交换层析装有C M S c p h a r o s ef a s tf l o w 的层析柱(I 0 7 0 c m)用5 0m m o l L,p H5 0 的N a z H P O 柠檬酸缓冲液充分平衡后将蛋白样品上柱,以O 6 m o l LN a C
9、I(溶于同样缓冲液中)盐离子梯度洗脱,洗脱速度为1 8 m l h。然后测定洗脱液蛋白峰中的纤维素酶及B-葡萄糖苷酶活力收集活力峰部分。2 6 4D E A E S e p h a r o s ef a s tf l o w 阴离子交换层析将阳离子交换层析得到的酶蛋白液利用超滤法转换缓冲液(转为5 0 m m o l L,D H8 0的T r i s。H C l 缓冲液)并浓缩,加样到用5 0 m m o l L,p H8 0 的T r i s n c l 缓冲液充分平衡的D E A E-S e p h a r o s ef a s tf l o w 层析柱(1X7 c m),然后用0 o 6
10、 m o l 几N a C l(溶于同样缓冲液中)盐浓度连续线性梯度洗脱洗脱速度为1 8 m l h,收集穿过峰和洗脱峰并进行酶活测定。2 6 5 置换层析方法置换剂为阴离子置换剂n 卡拉胶水解物,平均分子量为2 1 k D a。实验方法和步骤同2 6 4,把其中的N a C l 盐浓度连续线性梯度洗脱过程,改为用含5 m g m l 置换剂的缓冲液进行置换洗脱。蛋白被完全洗脱后,停止用置换剂洗柱。改用含l m o l LN a C I 的缓冲液洗柱约3 倍柱体积,洗脱置换剂,最后用缓冲液充分平衡,完成层析柱的再生过程2 7 电泳分折【9 I采用S D S 一聚丙烯酰胺凝胶(S D S P A
11、 G E)垂直板式不连续电泳胶厚1 m m,分离胶浓度为1 0,浓缩胶浓度为3 7 5,电极缓冲液为p H8 3 的T r i s o 甘氨酸缓冲液。3 结果与讨论3 1 卡拉胶的水解b 卡拉胶多塘中的糖苷键在稀酸溶液中会发生髓机的水解,通过控制水解时间可以得到不同平均分子量的k 卡拉胶的有限水解物。由表1 可知k 卡拉胶水解物的平均分子量随水解时间的延长而逐渐降低。根据C h e r t 和S c o u t e n 例的实验表明,低分子量的置换剂具有较好的置换层折结果所以本实验采用平均分子量为2 1 k D a 的b 卡拉胶作为蛋白质置换层析的置换剂。万方数据3 2 纤维素酶的层析分离3
12、2 1利用常规层析手段进行纤维素酶组分的分离通过S e p h a d e xG 1 0 0 凝胶过滤层析,得到主要的纤维素酶蛋白峰(如图1)。收集纤维索酶蛋白峰,在p H5 0 条件下进行C M S e p h a r o s ef a s tf l o w 阳离子交换层析。结果显示两种纤维素酶系组分:纤维素酶内切酶组分和B 葡萄糖苷酶组分都不吸附,同时出现在穿过峰里。将这一穿过峰收集并改换缓冲液后用D E A E S e p h a r o s ef a s tf l o w 进行弱阴离子交换层析。结果两种酶组分都能被吸附到D E A E-S e p h a r o s e 柱上。经N a
13、 C I 连续梯度洗脱,第一洗脱峰中同时具有较高的内切酶和 葡萄糖苷酶活性,两者没有得到分离(如图2)。S D S 凝胶电泳显示第一洗脱峰主要含有两种组分。摹V超溢智罂洗脱体鼎m I)-O-水杨素醇活-一C M C 酶活一蛋白含量F i g iC h r o m a t o g r a p h yo f t h eE n z y m e0 1 1s c o h a d HG 1 0 0洗脱体祝(-1)o 一水桶囊醇活C M C 酶活啦帅一盐诳度F i g 2C h r o m a t o g r a p h yo f t h eE n 习n n eO nD E A E-S c D h a r
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