高效液相色谱_柱后衍生法检测养殖水体及沉积物中11种磺胺药物残留.pdf

年月 技术与应用 ：通讯联系人 ：，收稿日期：高效液相色谱柱后衍生法检测养殖水体及沉积物中 种磺胺药物残留刘菁华，孙振中，黄雪玲，郭霞，孙建华（上海市水产研究所，上海市水产品质量监督检验站，上海 ）摘要：建立了养殖水体及沉积物中 种磺胺化合物的高效液相色谱柱后衍生分析方法。养殖水体过滤后采用 固相萃取柱进行净化、富集；沉积物采用甲醇 缓冲液（，）提取，固相萃取柱净化富集。经高效液相色谱分离，用荧光胺衍生试剂进行柱后衍生，荧光检测器检测。对柱后衍生系统参数进行了优化，确定了荧光胺溶液的浓度、流速和反应温度分别为 、和 ，磺胺化合物在 范围内线性显著，其相关系数值大于 。种磺胺类药物在养殖水体和沉积物中的加标回收率分别为 和 ，相对标准偏差为 和 ，检出限（，）为 和 ，定量限（，）为 和 。该法可应用于养殖环境中磺胺类药物的定性定量检测，具有较好的实用性。关键词：高效液相色谱；柱后衍生；磺胺；养殖水体；沉积物中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，）：（），（，），（），（，）（，），：（）；（）；第期刘菁华，等：高效液相色谱柱后衍生法检测养殖水体及沉积物中 种磺胺药物残留磺胺类（）药物是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的人工合成抗菌药，被广泛应用于水产养殖中以治疗和预防鱼类疾病，由于现实生活中存在该药物的滥用现象，导致养殖水体中未被吸收以及残留的药物在水体中累积，并随水中悬浮颗粒沉降，吸附到池塘沉积物中。该类药物降解速度较慢，残留时间长，通过生物富集作用对水体生态系统和水产品质量产生重要影响，导致市售水产品中该类药物含量超标，对人类健康产生巨大威胁，。因此，开展养殖水体及沉积物中磺胺类药物残留技术研究，可为保障水产品安全等提供技术支持。水产养殖环境中磺胺类药物残留检出情况时有发生，何秀婷等对广东沿海大亚湾和阳江两个典型海水养殖区进行调查，结果显示在所有沉积物样品中都能检出磺胺类抗生素，含量（干重）范围为：。阮悦斐等在天津淡水养殖场沉积物中检出种磺胺类药物，浓度范围为 。王敏等对滨海养殖虾池水样中抗生素残留情况的调查研究表明，磺胺类药物是主要的残留抗生素之一，磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲恶唑是其典型代表，最高质量浓度分别为 、和 。有关磺胺类药物的分析国内外报道均较多，主要有酶联免疫法、气相色谱质谱法、高效液相色谱法（）和 质谱联用法 。目前较为常用的是 紫外检测法和荧光检测法，以及液相色谱串联质谱法。液相色谱串联质谱法灵敏度较高，杜玥等 利用液相色谱串联质谱法测定猪肉中的 种磺胺，磺胺类药物的定量限（）为 。唐才明等 采用液相色谱串联质谱法对水环境中的微量磺胺进行检测，海水和城市污水中抗生素的方法定量限分别为 和 。但是液相色谱串联质谱仪较为昂贵，使用成本较高。液相 色 谱紫 外 检 测 法 的 灵 敏 度 较 低，卢 坤等 利用液相色谱紫外检测法检测蜂蜜中类抗生素残留，其中种磺胺类药物的定量限为 。杨晓蕾等 也采用液相色谱紫外检测法对土壤中种磺胺抗生素药物进行了检测，种 的检出限（）为 。而采用 柱后衍生法，经色谱柱分离的磺胺类药物，在柱后反应单元中与荧光胺（）反应，生成具有荧光特性的分子，经荧光检测器定量检测，其检测灵敏度和定性的准确性都有显著提高。李学德等 采用 荧光检测法同时测定蔬菜中种磺胺类药物残留，种磺胺类药物的定量限为 。黄冬梅等 采用柱 后衍生 法测定虾中 种磺胺类药物残留量，种 的定量限为 。该法与液相色谱串联质谱法的灵敏度接近。固相微萃取柱为应用较多的水样及沉积物中抗生素的萃取富集方法，对样品中含量较多的腐殖质等杂质去除效果显著，样品分析干扰少。本研究针对养殖沉积物及养殖水体，采用 固相萃取与 柱后衍生联立技术，建立了可同时检测 种磺胺类药物残留的检测方法，具有较好的实用性。实验部分 实验设备与试剂高效液相色谱仪（），型柱后衍生仪（美国 公司），型离心机（德国 公司），涡旋振荡 器（），超 纯 水 机（美 国 公司），型 计（美国 公司）。甲醇和乙腈为色谱纯（公司）。乙酸（优级纯）、柠檬酸和乙二胺四乙酸二钠购自国药集团化学试剂有限公司。荧光胺（纯度）购自美国 公司。磺胺标准品：磺胺嘧啶（，）、磺胺噻唑（，）、磺胺甲基嘧啶（，）、磺 胺甲 氧 嘧 啶（，）、磺 胺 二 甲 基 嘧 啶（，）、磺 胺 甲 氧 哒 嗪（，）、磺胺氯哒嗪（，）、磺胺甲基异恶唑（，）、磺胺多辛（，）、磺 胺 异 恶 唑（，）、磺胺二甲氧哒嗪（，）购自德国 ，纯度均不低于 。标准贮备溶液：准确称取 种磺胺标准品各 ，分别置于 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成 的标准储备液，密封，保存。混合标准贮备液：分别取 种磺胺标准贮备液各 于 容量瓶中，用甲醇定容，配制成 混合标准贮备液，于 保存。缓冲液的配制：取 柠檬酸、和 乙二胺四乙酸二钠溶于 水中，调节 。荧光胺：取 荧光胺加入 乙腈、乙酸和 色谱第 卷 甲醇溶解。样品制备及净化取 水样，用 滤膜过滤，滤液通过 固相萃取柱进行富集（柱使用前用 甲醇和 水活化），富集后干燥 ，用 甲醇洗脱，洗脱液浓缩至近干，用乙腈甲醇乙酸（，）定容至 待测。称取 沉积物样品，置于 聚丙烯离心管中，加入 甲醇乙二胺四乙酸二钠缓冲溶液（，）进行提取；涡旋 混匀，超声波提取 ，再振荡 ，离心 ，取上清液，重复上述操作两次。合并提取液，旋蒸浓缩至 ，取 过 柱，柱预先用 甲醇和 水活化，上清液过柱后，再用 水和 （）的甲醇淋洗，最后用 甲醇洗脱，氮气吹干后用流动相定容至 ，滤膜过滤后，通过 分析。标准曲线的绘制用乙腈甲醇乙酸（，）稀释混合标准储备液，取适量稀释后的混合标准储备液用乙腈甲醇乙酸（，）定容至所需标准系列：每种磺胺的质量浓度均为 、。取上述混合标准工作液各，进样检测。绘制 种药物的标准曲线并计算回归方程。添加回收率及精密度测定取养殖水样 ，添加目标磺胺抗生素药物溶液，配制、和 个水平，混匀，每个水平设置个平行样品。取沉积物样品 ，置于 聚丙烯离心管中，定量加入 种磺胺类药物标准品，配制、和 个含量水平，混匀，静置。每个水平设置 个平行样品。按照 节处理后，取 进样，经 检测，根据峰面积计算回收率及精密度。检出限和定量限的测定将 种磺胺类农药分别加入空白样品中，按照 节处理后，经 检测，按和，确定检出限和定量限。分析条件色谱条件：色谱柱（，）；流速：；柱温；激发波长 ，发射波长 ；进样量；流动相为乙腈、甲醇和（）乙酸水溶液，梯度洗脱条件见表。衍生化条件：衍生化试剂流速 ；柱温；柱后反应器温度。表梯度洗脱条件 （）（）（）结果与分析 标准曲线通过 荧光检测器测定峰面积，以磺胺类化合物的峰面积为纵坐标，对应待测物的质量浓度为横坐标（），分别获得 种磺胺类药物的标准曲线和回归方程，如表所示，种磺胺类药物在 范围内线性显著，其相关系数值大于 ，并且具有较好的色谱分离效果（见图）。表 种磺胺类药物的线性方程及相关系数（）（）：；：，：；：；：；：；：；：；：；：；：；：；：沉积物样品预处理方法的优化根据磺胺类药物的性质及与沉积物表面的吸附机理，酸性条件有利于破坏氢键，使药物更容易与污泥解 离。本 方 法 在（）的 乙 酸 和 缓冲液中分别加入适量有机试剂作为提取剂，分别研究不同提取剂对养殖沉积物中磺胺抗生素提取效率的影响，比较其提取效果（见图）。由图可看出，使用溶剂 作为提取剂，沉积物中 种磺胺均获得较好的回收率，回收率达到 以第期刘菁华，等：高效液相色谱柱后衍生法检测养殖水体及沉积物中 种磺胺药物残留图 种磺胺类药物标准溶液（）的 柱后衍生色谱图 （）上。溶剂和溶剂作为提取剂，两者回收率效果相当，回收率均在 以上。溶剂和溶剂作为提取剂，两者回收率亦相近，回收率均高于。由此推断，随着有机相的增加，和 作为提取剂时，回收率明显提高，单纯使用缓冲盐作为提取剂不如将有机试剂与其配比，获得最佳提取效果。然而，以溶剂 作为提取剂，与较低有机相比例混合试剂相比，回收率反而降低，这可能是由于混合溶液极性增强，弱酸性条件被破坏，导致萃取效率下降。综合考虑，本研究选用溶剂 作为提取剂，由于提取剂中有机相比例较高，且有较强极性，在前处理过程中图不同提取剂对沉积物中磺胺类药物的提取效果 ：（，）；：（，）；：；：（，）；：；：（，）；：（，）如果直接通过 进行富集浓缩，目标化合物会随甲醇而流失，使回收率降低，因此，在前处理过程中对提取液进行旋蒸浓缩，减少甲醇对回收结果的影响。研究表明，样品处理过程中同时采用超声和振荡，提取效果更好，提取回收率为 。色谱检测方法的确定 仪器条件的优化由于磺胺类药物具有弱极性，选用液相色谱较为常用的 柱作为色谱柱进行分离，结果显示 种磺胺类药物在 色谱柱上获得了理想的分离效果。分离多种磺胺类化合物时，由于化合物之间存在极性差异，单纯采用等度洗脱很难同时分离多组分药物，选用梯度洗脱可以获得良好的分离效果。在洗脱初始阶段采用低比例有机相作为流动相，先将极性强的组分洗脱出来，然后增加有机相乙腈的比例，逐步分离出非极性化合物，进而实现各组分的有效分离。由于磺胺类药物具有弱碱性，值对磺胺类化合物在色谱柱上的保留时间有重要影响，因此，可参考肉类及水产品中磺胺类药物的分析方法，在流动相中加入乙酸控制 值，同时可弱化色谱柱内硅醇基与磺胺之间的相互作用，减少拖尾峰，改善磺胺类药物的色谱峰形，提高分离效果。柱后衍生条件的优化柱后衍生效果主要与反应温度、荧光胺溶液浓度和衍生试剂流速有关，为获得稳定的检测效果，本研究针对这个参数做了条件实验，结果见图。在 范围内，种磺胺类药物的峰面积随着荧光胺溶液浓度的增加而增大，但是荧光胺浓度过高会在仪器上析出，析出物质沉积在仪器上对仪器造成损害，在满足化合物灵敏度达到检测要求的前提下，确定采用 的荧光胺溶液。在反应温度 范围内，磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的响应值在 达到最高，随着温度增加，响应值逐步降低；磺胺甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑和磺胺二甲氧哒嗪在 达到最高，但响应值变化幅度较小。最终确定 作为柱后衍生反应温度。化合物峰面积随衍生化试剂流速增大而趋于平稳，因此选择荧光胺流速为色谱第 卷图荧光胺溶液浓度、反应温度和流速对 种磺胺类药物峰面积的影响 ，。表养殖沉积物中磺胺类药物的回收率和 （）（）回收率及精密度养殖沉积物样本在、和 个添加水平，采用提取剂甲醇 缓冲液（，）进行提取，检测不同浓度的样本溶液，分别测其回收率以及精密度，考察富集效果。养殖水体设定、和 个添加水平，样品过滤后经过 固相萃取柱净化、富集后测定，结果见表和表。数据表明，养殖沉积物中磺胺类药物的平均加标回收率为 ，相对标准偏差为 。养殖水体中磺胺类药物的平均加标回 收 率 为 ，相 对 标 准 偏 差 为 。检出限和定量限在空白养殖水体及养殖沉积物中分别添加磺胺类药物混合标准溶液，以为时对应的质量第期刘菁华，等：高效液相色谱柱后衍生法检测养殖水体及沉积物中 种磺胺药物残留浓度为方法的检出限，以为 时对应的质量浓度为方法的定量限。养殖水体中 种磺胺类药物的检出限为 ，定量限为 。养殖沉积物中 种磺胺类药物的检出限为 ，定量限为 （结果见表）。表养殖水体中磺胺类药物的回收率和 （）（）表 测定养殖水体和沉积物样品中 种磺胺类药物的检出限和定量限 （）（）（）（）实际样品的检测应用本方法对上海市郊区某大型养殖基地采集的沉积物及水样进行检测分析，个样品中均未检出磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪。磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异恶唑在样品中有检出：个沉积物样品中检出磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异恶唑，含量分别为 和 。个水样中检出磺胺二甲基嘧啶，含量分别为 和 。结论本研究利用磺胺类药物与荧光胺反应的性质，建立了养殖水体及养殖沉积物中 种磺胺类药物残留的 柱后衍生技术。该法样品净化效果较好，衍生反应效率较高，种磺胺的定量限分别为 和 。与紫外法相比有更高的灵敏度，定性定量准确，且针对性和实用性强，为养殖环境中磺胺类药物的残留检测及其标准制定提供了有力参考。参考文献：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（何秀婷，王奇，聂湘平，等环境科学），（）：，（阮悦斐，陈继淼，郭昌胜，等农业环境科学学报），（）：，（王敏，俞慎，洪有为，等生态环境学报），（）：，（）：，（）：，（周爱霞，苏小四，高松，等分析化学），（）：，：色谱第 卷 ，（）：，：，（）：，（）：，：，（厉文辉，史亚利，高立红，等分析测试学报），（）：，（）：，（杜玥，杨慧元，徐伟东药物分析杂志），（）：，（唐才明，黄秋鑫，余以义，等分 析 测试学报），（）：，（卢坤，童群义分析测试学报），（）：，（杨晓 蕾，李 杰，李 学 文，等环 境 与 健 康 杂 志），（）：（刘海新食品科学），（）：，（李学德，鲜啟明，刘红玲，等分析化学），（）：，（黄 冬 梅，黄 宣 运，顾 润 润，等色 谱），（）：