PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究.pdf

第 4 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.2 2013 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr.,2013 基金项目:广东省科技项目(2010B020316007)、广东出入境检验检疫局科研项目(2011GDK15)Fund:Supported by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province,China(2010B020316007)*通讯作者:许龙岩,高级工程师,主要研究方向为食品安全检测。Email:*Corresponding author:XU Long-Yan,Senior Engineer,Technical Center of guangdong Entry-Exit Inspection&Quarantine Bureau,NO.66 Huacheng Avenue,Guangzhou.501623,China Email: PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究 许龙岩1*,袁慕云1,唐 勤2,阳 静1,邹志飞1,相大鹏1 (1.广东出入境检验检疫局 广州 510623;2.南方医科大学 广州 510515)摘摘 要要:目的目的 建立副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的 PCR-焦磷酸测序方法。方法方法 根据副溶血性弧菌 toxR 基因设计扩增引物和测序引物,先用 PCR 特异性地扩增目的片段,再制备单链模版,最后用焦磷酸测序法检测 DNA 碱基序列,检测的序列为 CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT,则判断为副溶血性弧菌。结果结果 扩增引物和测序引物表现出良好的特异性。PCR 扩增结果:20 株 VP 均扩增出大小为 137 bp 的 DNA 片段,而创伤弧菌等对照菌株未扩增出 DNA 条带。焦磷酸测序结果:20 株副溶血性弧菌均测出与预期相符的 DNA 碱基序列,而其他对照菌株未测出 DNA 碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。VP标准菌株ATCC 17802发生A-T突变,密码子CCU变成CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子。结论结论 该方法特异性高,是快速检测 VP 有效手段。关键词关键词:副溶血性弧菌;聚合酶链式反应;焦磷酸测序;DNA 碱基序列;toxR 基因 Detection of Vibrio parahaemolyticus by PCR-pyrosequencing XU Long-Yan1*,YUAN Mu-Yun1,TANG Qin2,YANG Jing1,ZOU Zhi-Fei1,XIANG Da-Peng1(1.Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center,Guangzhou 510623,China;2.Southern Medical University,Guangzhou 510515,China)ABSTRACT:Objective To establish a method for the detection of Vibrio parahaemolyticus(VP)by poly-merase chain reaction(PCR)-pyrosequencing.Methods Amplification primers and sequencing primers were designed according to the toxR gene of VP.Then,the target fragment was amplified specifically by PCR and single-stranded DNA template was obtained from the PCR products.Finally,the base sequence was detected by pyrosequencing under the guidance of the sequencing primers.Vibrio parahaemolyticus could be confirmed when the target fragment CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT was detected.Results PCR primers and sequencing primers showed a good specificity.PCR results showed that 20 VP trains could be amplified to 137 bp DNA fragments,while Vibrio vulnificus and other control strains could not.Meanwhile,pyrosequencing results showed that 20 VP were consistent with the expected results,while the other control strains could not be detected the sequences or the test results did not match the sequences of sequencing prim-ers.In addition,VP standard strain ATCC 17802 appeared A-T mutation.As a result,codon CCU became the CCA,both of which are proline codon.Conclusion This method showed a good specificity,and it could be used for the detection of VP rapidly.KEY WORDS:Vibrio parahaemolyticus;polymerase chain reaction(PCR);pyrosequencing;DNA base se-quence;toxR gene 第 2 期 许龙岩,等:PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究 529 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种引起食源性疾病的重要病原菌1,近年来在沿海地区的食物中毒病例中,该菌已成为首要致病原2。随着分子生物学的发展,已有用普通 PCR 或荧光 PCR 检测 VP 的报道3-5,虽然这些方法可达到快速、高通量的目的,但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列,因此有出现假阳性的可能。焦磷酸测序(pyro-sequencing)技术是近年来发明的一项进行短片段DNA测序的实时检测技术,该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记,可直接测定测序引物后面的碱基序列,通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物,同时该技术主要分析对象是 PCR产物双链中的一条链的序列,避免了由于 DNA 链的二级结构造成的人工假象,使测序结果更加准确6。本研究根据 VP toxR 基因(GenBank:AB063113),设计扩增引物和测序引物,建立了结合 PCR-焦磷酸测序从 DNA碱基序列水平上检测 VP 的方法,并评价了方法的特异性,与传统检测方法的符合性,以期实际应用于食品中 VP 的检测。1 材料与方法 1.1 菌株信息 副溶血性弧菌菌株共 20 株,其中标准菌株 1 株,菌株号为 ATCC17802,食品中分离的 VP 菌株 19 株,编号为 VP1-VP19。阴性对照株 11 株,分别为创伤弧菌 ATCC27562、溶藻弧菌 CGMCC1.1833、海蛹弧菌CGMCC1.1623、弗氏弧菌 CGMCC1.1613、最小弧菌CGMCC1.1969、大肠杆菌 ATCC25922、单增李斯特菌 ATCC19115、阪崎肠杆菌 ATCC29544、痢疾志贺氏 菌 NICPBP51252、小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌CMCC52221、塔氏弧菌分离株。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国药品生物制品检定所、中国科学院南海水产研究所、辽宁出入境检验检疫局技术中心和广东出入境检验检疫局技术中心。所有菌株均经 VITEK2 和 API 试剂条进行确证。1.2 仪器和试剂 焦磷酸测序 PyroMark lD 系统(瑞典 Biotage 公司);PE 9700 型 PCR 扩增仪;核酸提取仪(日本 PSS公司);PCR 用 Buffer、dNTP、琼脂糖、PCR 分子量标记(50500 bp)、Taq酶(大连宝生物工程有限公司);链亲和素标记磁珠(sepharose beads)(GE.Healthcare公 司);焦磷酸测序用酶、dNTP、结合缓冲液(Binding Buffer)、退火缓冲液(Annealing Buffer)、变性缓冲液(Denaturation Buffer)、洗涤缓冲液(Washing Buf-fer)(QIAGEN 上海办事处);碱性蛋白胨水(北京陆桥有限公司)。1.3 引物设计 根据 VP 的 toxR 基因(GenBank:AB063113)序列中的保守区域,用 PyroMark Assay Design 软件设计扩增引物和测序引物,上游引物 F:GAGATTCC GCTGGGTTTGTAA,下游引物 R:TGAACCAGAAG CGCCAGTAGTAC,测序引物 S:AAATAACGCGTG GAAT,扩增片段为 137 bp,下游引物 5端标记生物素,委托宝生物工程(大连)有限公司合成。1.4 模板制备 所有菌株均用 3%碱性蛋白胨水 36 培养 810 h,取 1 mL 菌悬液移入离心管,12000 r/min 离心 5 min 去上清,用 1 mL 去离子水漂浮沉淀,12000 r/min离心 3 min 去上清,重复两次,最后加 200 L 去离子水在核酸提取仪上提取 DNA,用于 PCR 扩增。1.5 PCR 扩增体系及电泳参数 扩增体系 50 L,PCR Mix Buffer 25 L,Taq 酶 5 L,MgCl2 1 L,10 mol/L 上、下游引物各 2 L,模板 1 L,去离子水 14 L。循环参数为预变性 95 4 min,95 15 s,65 30 s,72 30 s,43 个循环,72 12 min,4 保存。PCR 扩增产物一部分在 2%琼脂糖凝胶上电泳,另一部分用于焦磷酸测序。1.6 单链模板制备及焦磷酸测序 将 15 L PCR 产物转移至 96 孔 PCR 板中,加入2 L 磁珠(sepharose beads),20 L 结合缓冲液(Binding Buffer)和 43 L 纯水,常温震荡混匀 20 min;打开真空泵,将真空预装工具 prep tool 在高纯水中清洗 30 s,将 prep tool 移到 96 孔 PCR 板中,抓取其中的磁珠,待磁珠基本抓取完毕后将携带有磁珠的prep tool 放入 70%乙醇中 5 s,再分别在变性缓冲液 Denaturation Buffer 和洗涤缓冲液 Washing Buffer 中各清洗 2030 s,prep tool 放在装有退火预混液 PSQ 96 板(预先加入 43 L 退火缓冲液 Annealing Buffer和 2 L 测序引物)的上方,关掉真空泵,轻轻摇动释放磁珠,将 PSQ 96 板在 80 放置 5 min,自然冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。测序程序采用 SQA模式,按 ATCG 的碱基排列顺序,依次循环加入 15530 食品安全质量检测学报 第 4 卷 次,根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底物混合物、酶混合物和 4 种脱氧核糖核苷酸,将 PSQ96 孔板和试剂仓放入 PyroMark lD 系统中进行焦磷酸测序。测序峰及相应的 DNA 碱基序列由仪器 SQA 软件自动分析产生。1.7 焦磷酸测序结果判断 检测所得DNA碱基序列与toxR基因测序引物后的 DNA 碱基序列比对判断结果。焦磷酸测序是从测序引物后的第一个碱基开始测序,在 NCBI 网站的BLAST 功能反复比对时发现,toxR 基因测序引物后的 34 个 DNA 碱基序列,即 CCAAGGATTCACAGC AGAAGCCACAGGTGCTTTT,可鉴定为 VP。因此,检测所得 DNA 碱基序列与上述序列 100%匹配,则判断为 VP。1.8 模拟样品检测 用均质带分别秤取 25 g 猪肉、对虾(进出口样品,用 GB4789.7-2010 方法检测,未检出 VP),每份样品中加入 225 mL 碱性蛋白胨水,分别加入 1 mL 浓度为 102 cfu/mL 的副溶血性弧菌 ATCC17802 菌悬液,用拍击式均质器拍打 2 min,36 培养 1012 h,然后取一部分按上述步骤提取 DNA 进行焦磷酸检测,另一部分按 GB4789.7-2010食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验继续进行检测。2 结果与分析 2.1 PCR 扩增结果 toxR 基因 PCR 扩增结果,20 株 VP 均扩增出 137 bp 大小的 DNA 片段(图 1),而创伤弧菌、溶藻弧菌、海蛹弧菌、弗氏弧菌、最小弧菌、阪崎肠杆菌、痢疾 志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、塔氏弧菌、单增李斯特菌未见扩增条带(图 2)。从图 2 可以看出,第 7泳道的大肠杆菌在 100150 bp 处有 DNA 扩增条带,其扩增产物用焦磷酸测序检测,仪器读出的 DNA 碱基序列为 CTGTTTCTTC TCCC(图 3),该序列与测序引物后的 31个 DNA碱基序列 CCAAGGATTCACAG CAGAAGCCACAGGTGCTTTT 比对,结果完全不匹配,因此,可判断该菌株为非 VP,是 PCR 非特异性扩增。2.2 焦磷酸测序结果 20 株 VP 焦磷酸测序结果,测出 4448 bp 大小不等的 DNA 碱基序列(表 1,图 4、图 5;本研究只列出 VP ATCC17802 和 VP 1 的焦磷酸测序结果),而11 株对照菌株创伤弧菌、溶藻弧菌、海蛹弧菌、弗氏弧菌、最小弧菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、塔氏弧菌、单增李斯特菌,未测出 DNA 碱基序列或测得结果与测序引物后的序列不匹配(本研究只列出大肠杆菌和创伤弧菌的焦磷酸测序结果图，见图 3,图 6)。从表 1 和图4 观察到,VP 标准菌株 ATCC 17802 的第 4 个碱基为T,在 NCBI 网站查找 ATCC 17802 的 toxR 基因序列(GenBank:JF930556.1),发现该位点的碱基为 A,表明实验菌株在该位点发生了 A-T 的突变。查找 toxR 基因编码蛋白氨基酸序列,共 292 个氨基酸组成,突变位点是 toxR 蛋白的第 176 个氨基酸-脯氨酸位点,该位点发生 A-T 的突变后,密码子 CCU 变成 CCA,而两个密码子都是脯氨酸的密码子,表明该位点虽然发生了突变但其氨基酸序列没有改变,以致该基因表达的跨膜转录激活蛋白没有变化。20 株 VP 测序所得DNA碱基序列,分别与测序引物后的DNA序列 图 1 20 株 VP toxR 基因 PCR 扩增电泳图 Fig.1 PCR-electrophoresis results of toxR gene from 20 VP trains M:50 bp maker 1:VP ATCC17802 220:VP1-VP19 21:去离子水(ddH2O)第 2 期 许龙岩,等:PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究 531 图 2 VP toxR 基因特异性试验 PCR 扩增电泳图 Fig.2 PCR-electrophoresis results of VP toxR gene specificity test M:50 bp maker 1:VP ATCC17802 2:创伤弧菌 3:溶藻弧菌 4:海蛹弧菌 5:弗氏弧菌 6:最小弧菌 7:大肠杆菌 8:阪崎肠杆菌 9:痢疾志贺氏菌 10:小肠结肠炎耶尔森氏菌 11:塔氏弧菌 12:单增李斯特菌 13:去离子水 比对,发现 100%匹配的 DNA 碱基数为 3548 bp,所有有效测序结果均超过 35 个碱基(表 1),表明测序引物的特异性较好,反应体系优化也较佳,并且可用CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTT T 的 DNA 碱基序列特异性地检测 VP。2.3 模拟样品焦磷酸测序检测结果 添加 VP ATCC17802 菌悬液的猪肉、对虾模拟 样品,焦磷酸测序结果前 34 个 DNA 碱基序列均为CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTT T(图略)。按照 GB4789.7-2010食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验检测的模拟样品,均分离鉴定出VP,结果与本研究建立的焦磷酸测序方法一致。3 讨 论 副溶血性弧菌是一种重要的食源性病原菌,其引发的食源性疾病是当前面临的公共卫生问题之一。VP 的 PCR 分子检测方面,以 tdh 基因为目的基因判断其有无致病性非常实用,但 tdh 基因家族广泛存在于人类致病性弧菌中,如大多数霍利斯弧菌,某些拟态弧菌,非 O1 群霍乱弧菌等,因此,用 tdh 检测VP 存在一定的局限性7-9。以 tlh 为目的基因也可能出现同样的情况,Robert Pillot 等10的研究发现,溶藻弧菌和副溶血性弧菌的同源性非常高,靶定tlh基因的引物不能用于两者的鉴别。Croci 等11评估了不同靶基因的副溶血性弧菌的 PCR 鉴定方法,指出 toxR 作为靶基因的 PCR 具有最高的准确性,该基因可作为VP 分子鉴别的参考方法。焦磷酸测序是一种基于合 表 1 副溶血性弧菌测序检测结果 Table 1 Sequencing test results of Vibrio parahaemolyticus 菌株编号 检测的 DNA 碱基序列 检测的 碱基数 比对匹配 碱基数 ATCC17802 CCATGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTACTA 44 43 VP1 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTACTA CTGG 48 48 VP2 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTA CTA CTGG 48 48 VP3 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTA CTA CTGG 48 48 VP4 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTA CTA CTGG 48 48 VP5 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGT ACTACTGG 48 48 VP6 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT T GCTAGT ACTCTG 46 35 VP7 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGTACTACTG 46 38 VP8 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAG TA TACTGG 46 38 VP9 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGTACTACTGG 47 47 VP10 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAG TACTACTGG 47 38 VP11 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TC TAGTACTACTG 46 36 VP12 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TC TAGGTACTACTGG 49 36 VP13 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TC TAGTACTACTGG 48 36 VP14 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTACTACTGG 48 48 VP15 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTACTACTGG 48 48 VP16 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAG TACTACTGG 47 38 VP17 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGTA CTA CTGG 48 48 VP18 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAG TA CTACTGG 47 38 VP19 CCAAGGATTC ACAGCAGAAG CCACAGGTGC TTTT TCAGGT ACTACTGG 48 48 532 食品安全质量检测学报 第 4 卷 图 3 大肠杆菌焦磷酸测序结果 Fig.3 Sequencing test results of Escherichia Colis 图 4 VP ATCC17802 焦磷酸测序结果 Fig.4 Sequencing test results of VP ATCC17802 第 2 期 许龙岩,等:PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究 533 图 5 VP 1 焦磷酸测序结果 Fig.5 Sequencing test results of VP1 成的新型 DNA 测序技术,在特异引物的引导下,根据待测序列分别加入四种核苷酸,在延伸的过程中释放焦磷酸,后者在 ATP 硫酸化酶和荧光酶的偶联反应中释放荧光,通过检测器检测相应的荧光强度,从而获得检测样本中的核苷酸序列,是一种非常实用的短序列实时检测技术,已应用于临床微生物的分离鉴定及耐药监测,其定量准确、易于自动化、能实现高通量的大样本的快速检测,具有 DNA 测序法无法比拟的优势12-20。本研究以 VP toxR 基因中的保守区域,设计扩增引物和测序引物,建立了PCR-焦磷酸测序从DNA碱基序列水平上检测 VP 的方法,先对样品进行选择性增菌后用 PCR 进行目标片段的扩增,保证扩增片段的特异性,再用扩增产物制备单链模板,在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。本研究焦磷酸测序程序采 用 SQA 模式,按 ATCG 的碱基排列顺序,依次加入底物混合物、酶混合物和 4 种脱氧核糖核苷酸，循环15 次,同样模式下增加循环,会增加检测的 DNA 碱基长度,但会增加试剂的消耗也增加检测时间。用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现,toxR基因测序引物后的碱基序列具有良好的特异性,测序引物后 34 bp 长的连续 DNA 序列即:CCAAGGA TTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT 就可鉴定为 VP。因此,本研究判断结果的依据为检测的 DNA碱基序列与测序引物后的序列比对,前 34 个碱基序列与上述序列 100%匹配,则判断为 VP。PCR 扩增引物和测序引物表现出良好的特异性和准确性,20 株 VP 均扩增出大小 137 bp 的 DNA 片段,而创伤弧菌等其他对照菌株未扩增出 DNA 条 534 食品安全质量检测学报 第 4 卷 图 6 创伤弧菌焦磷酸测序结果 Fig.6 Sequencing test results of Vibrio vulnificus 带。虽然一株大肠杆菌在 137 bp 位置出现扩增带,但测序试验结果判断为非 VP。20 株检测的 VP DNA 碱基序列与测序引物后的碱基序列比对,100%匹配的碱基数分别为 3548 bp,均超过需检测的 34 个 DNA碱基序列,而其他创伤弧菌等对照菌株未测出 DNA碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。模拟样品检测时,焦磷酸测序结果与传统检测方法一致,但在检测周期上传统方法需经培养、划线分离、生化鉴定等,需要 34 d,而焦磷酸测序方法增菌810 h、核酸提取、PCR 扩增和焦磷酸测序 34 h,整个实验1114 h完成,简便快捷,而且可通DNA碱基序列的水平上检测 VP,避免了单纯 PCR 扩增检测易污染造成的假阳性结果,准确性高,具有较好的应用前景。参考文献 1 Joseph SW,Colwell RR,Kaper JB,et al.Vibrio parahaemolyti-cus and related Hallophilic vibriosJ.Crit Rev Microbiol,1982,10:77124.2 程苏云,罗芸,叶菊莲,等.副溶血性弧菌快速检测方法研究J.疾病监测,2007,22(9):642645.Cheng SY,Luo Y,Ye JL,et al.Study on rapid detection of Vi-brio parahaemolyticusJ.Dis Surveillance,2007,22(9):642 645.3 许龙岩,周宏斌,高东微,等.MPCR 检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究J.卫生研究,2005,34(1):115118.Xu LY,Zhou HB,Gao DW,et al.Research on detection of Vi-brio comma and Vibro parahaemolyticus from foodstuffs 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