非正常食用油的在线甲基化-－-气相色谱测定及模式识别分析研究.pdf

第 32 卷第 8 期分析试验室Vol.32 No 82013 年 8 月Chinese Journal of Analysis Laboratory2013 8收稿日期:2013-01-31基金项目:浙江省大学生科技创新活动计划项目(2012403072)资助E-mail:hifeihappy126 com非正常食用油的在线甲基化 气相色谱测定及模式识别分析研究傅宇飞，张佩佩，潘再法，王丽丽*(浙江工业大学化学工程与材料学院，杭州 310014)摘要:建立了食用油中脂肪酸组成的在线水解甲基化 气相色谱测定方法，分析了 20 余种常用食用油与非正常食用油样品。将 1 L(3 mg/mL)油脂样品与 2 L 衍生化试剂四甲基氢氧化铵(TMAH，25%甲醇溶液)加入裂解器，在350 下，油脂加水分解瞬间衍生化成相应的脂肪酸甲酯。基于气相色谱图上分离鉴定到的 10 个共有峰的相对强度，建立了食用油的气相色谱指纹图谱。结合化学模式识别即主成分分析和系统聚类分析对合格食用油和非正常食用油样品的色谱图进行了识别分析。结果表明，建立的指纹图谱结合模式识别技术可以较好的区分合格食用油与非正常食用油样品。关键词:气相色谱;在线水解甲基化;主成分分析;聚类分析;食用油;脂肪酸中图分类号:O657.7文献标识码:A文章编号:1000-0720(2013)08-103-06近几年来食品安全成为热门话题，尤其是非正常食用油流于食品市场，因此食用油的品质备受关注。非正常食用油(俗称地沟油)，一般指从下水道中的油腻漂浮物或泔水提炼出的油，或劣质动物器官组织经加工提炼的油和煎炸老油，以及含有这些油的勾兑油。由于这类非正常食用油的主要化学成分与正常食用油具有很大的相似性，很难找到特征性的化学物质，因而其指示物筛选及检测非常困难。原有的各种检查方法如常规检测法1，电导率法2，荧光分析法3，近红外光谱法4，气相色谱法5、顶空气相色谱/质谱法(GC/MS)6 等都存在着或特征指标专一性不强，或检测灵敏度不高的缺点，或检测准确性不高，仅能在一定范围内适用特定类型的餐厨废油脂的检测。因此，完善食用油检测方法，健全食用油安全保障体系已成为当务之急。在线水解甲基衍生化 气相色谱法(On-line hydrolysis and methylation-Gas chromatography，OHM-GC)是近年来迅速发展的一种快速分析有机酸、酯类等物质的方法7。该法采用样品与衍生化试剂同时进样，在裂解器的高温下，有机酸等成分可定量的生成其甲基衍生化产物，该法避免了繁琐的衍生化前处理，具有样品用量少、简便、分析时间短等优点8，9。色谱指纹图谱是一种从整体上研究复杂物质体系的技术，适合于无法通过一两个指标来全面评价其质量的物质的分析，在食品和中药材检测分析上已有较好的应用10，11。本文的目的是建立食用油中脂肪酸组成的在线水解甲基化 气相色谱测定方法，对测定其影响的主要因素如甲基化试剂、衍生化温度等进行优化。在最佳实验条件下，对 20 余种合格食用油和非正常食用油样品进行分析，尝试建立合格食用油的指纹图谱，并结合模式识别即主成分分析和聚类分析对区别非正常食用油的可行性进行研究。1实验部分1.1仪器与试剂CP3800 气相色谱仪(美国，Varian 公司);301第 32 卷第 8 期分析试验室Vol.32 No 82013 年 8 月Chinese Journal of Analysis Laboratory2013 8Py-3030iD双击式纵型微型炉裂解器(日本，FrontierLab 公司);Thermo Trace DSQ气相色谱-质谱联用仪(美国，Thermo Fisher 公司);BP 211D 电子天平(德国，Sartorius 公司)。四 甲 基 氢 氧 化 铵(Tetramethylammoniumhydroxide，TMAH，25%甲醇溶液，Aldrich 化学公司);甲醇(分析纯，衢州巨化试剂公司);食用油样品见表 1。表 1食用油样品表Tab.1The cooking oil and illegal cooking oil samples编号品种来源物理性状备注DD大豆油超市浅黄色，透明3 个，不同厂家或批次HS花生油超市黄色，透明3 个，不同厂家或批次YM玉米油超市黄色，透明3 个，不同厂家或批次SC山茶油超市浅黄色，透明2 个有机山茶油，1 个野生山茶油CZ菜籽油农家黄色，透明3 个，分别来自临安，绍兴，温岭自榨油KHZ葵花籽超市浅黄色，透明2 个，不同厂家或批次TH调和油超市浅黄色，透明1 个DG1非正常油餐饮店浅黄色，透明1 个，煎炸老油经过多次提炼DG2非正常油自制浅黄色，透明1 个，DG1+20%调和油DG3非正常油自制浅黄色，透明1 个，DG1+50%调和油1.2样品制备称取油酯样品约 0.003 g 到 1 mL 容量瓶中，加入甲醇溶液定容，得到溶液浓度为 3 mg/mL。1.3实验步骤取上述样品 1 L 加入到样品杯中，加入 2 L衍生化试剂。将样品杯固定在进样杆上，装入裂解器，待仪器稳定后，按下进样杆使样品杯自由落到预先设定温度的炉心，样品受热后瞬间发生水解甲基化反应，生成的产物立即由载气带入气相色谱进行测定。装置见图 1。图 1OHM-GC(/MS)分析装置示意图Fig.1Schematic diagram of OHM-GC(/MS)1.4色谱条件气相色谱:UA-5 色谱柱(30 m 0.25 mmi d 0.25 m 膜厚);柱温:初温 50，以10 /min 速率升到 240，保持10 min。汽化室和检测器温度均为 240，分流比 30:1，载气 N2，柱流量 1 mL/min。裂解器:裂解炉温度 350，色谱进样口温度300。质谱:传输线温度:280，电子轰击离子源(EI)，离子源温度:280，质谱扫描范围 40 650amu，采用 NIST 谱库进行鉴定分析。1.5定性和定量采用标准品对照和质谱解析方法定性。采用峰面积归一化法定量。2结果与讨论2.1食用油的在线衍生化 气相色谱法的建立植物油的主要成分是由 C14-C22 的直链脂肪酸与甘油生成的脂肪酸甘油酯。一定温度下脂肪酸甘油酯在衍生化试剂四甲基氢氧化铵(TMAH)存在下发生瞬间水解和甲基衍生化反应生成脂肪酸甲酯，原理见图 2。温度对反应的影响至关重要:温度过低，衍生化反应不完全;温度过高，脂肪酸甘油酯易分解损失。分别考察了 250，300，350401第 32 卷第 8 期分析试验室Vol.32 No 82013 年 8 月Chinese Journal of Analysis Laboratory2013 8和 400 对硬脂酸(C18:0)甘油三酯的甲基衍生化效果的影响，发现 250 时，由于低温衍生化不完全，三种脂肪酸的甲基衍生化物的色谱峰强度较低;随着温度的升高，峰强度逐渐增强，当温度到达350 时，衍生物色谱峰强度达到最大，并且在 350400 基本不变。因此，在以下实验中选择裂解器温度为 350。图 3 为最佳条件下测定花生油而得到的 GC图。由图 3 可见，大部分的峰集中在 15 30 min之间，20 min 前后的几个峰强度较大。并采用质谱同时进行了分析，定性分析依据 NIST 谱库检索结合人工解析。除 1 号和 10 号峰未能定性外，2 号到 9 号峰分别为十六碳酸甲酯(C16:0)、十八碳烯酸甲酯(C18:1)、十八碳酸甲酯(C18:0)、十八碳二烯酸甲酯(C18:2)、二十碳烯酸甲酯(C20:1)、二十碳酸甲酯(C20:0)和二十二碳酸甲酯(C22:0)。定量采用峰面积归一化法。对花生油样品重复测定了 5 次，各脂肪酸成分的质量分数的相对标准偏差(SD)小于 5%(n=5)，说明方法的重现性良好。图 2脂肪酸甘油三酯在 TMAH 共存下的在线水解甲基衍生化反应示意图Fig.2Schemes of OHM for triglyceride in presence of TMAH图 3花生油的在线甲基化 气相色谱图Fig.3Chromatogram of peanut oil obtained by OHM-GC2.2食用油的在线水解甲基化 气相色谱指纹图谱的建立为了考察和比较不同食用油中的脂肪酸组成，在最佳实验条件下测定 6 种食用油共 17 个批次食用油样品，得到的 GC 色谱图见图 4。1 3 为大豆油，4 6 为花生油，7 9 为山茶油，10 12 为玉米油，13 15 为菜籽油，16 17 为葵花籽油。比较图4 可知，食用油的脂肪酸组成基本相同，同种食用油的各峰强度基本一致，而不同种类的食用油除了峰强度有变化外，7 10 号峰(C20:1 C22:0)也有较明显的差别。除花生油中可观察到 7 10 号峰外;玉米油中只观察到 7 号、8 号峰，且峰强度较小;菜籽油中只观察到 7 号和 9 号峰，峰强度相对较大;而大豆油和葵花籽油均未观察到 7 10 号峰。选择这 10 个分离良好的色谱峰作为共有峰，所有谱图中共有峰面积分别占各总峰面积的 90%以上。满足指纹图谱技术要求12，可以体现各组样品的特征性。501第 32 卷第 8 期分析试验室Vol.32 No 82013 年 8 月Chinese Journal of Analysis Laboratory2013 8图 46 种食用油的 OHM-GC 指纹谱图Fig.4Fingerprints of six kinds of edible oils obtained by OHM-GC2.3指纹图谱的主成分分析和聚类分析此外还测定了 1 个调和油与 3 个非正常油，采用峰面积归一化法进行定量分析，得出 21 个样品的脂肪酸组成的质量分数，结果见表 2。通过对比表 2 的数据可以区分不同种类的食用油及非正常油脂样品，如正常食用油中均为 3 号峰(C18:1)含量最高，但在精制餐厨废油(DG-1)中为 2 号峰(C16:0)含量最高，经过掺兑的 DG-2 和 DG-3 非正常油中 3 号峰的质量分数有所增加，但 2 号峰的相对百分含量仍明显高于正常食用油。为了直观的区别 21 个油脂样品，将表 2 中的峰面积百分含量输入 SPSS 统计软件，调用因子分析模块进行主成分分析13，14。图 5 为提取三个主成分得到的 21个样品的主成分分析图。由图 5 可见，大豆油、山茶油、玉米油、葵花籽油、花生油各聚为一组;菜籽油因来源不同且由农户自制得到，因此聚集效果稍差;调和油与各种食用油也可以得到区分。同时由煎炸老油多次精炼后得到的 DG-1 样品与正常食用油也得到了很好的区分。而分别掺兑了 20%和50%合格调和油的 DG-2 和 DG-3 样品虽然与调和油样品有所接近，但仍能明显区分开。还采用 SPSS 统计软件中的聚类分析程序对表2 中的数据进行了聚类分析。图 6 为 21 个样品的系统聚类分析树状图，更直观的表现了样品逐步合并的过程。横坐标为类间的距离，纵坐标为样品名，临界值越小，表明谱图越相似。由图 6 可知，当临界值 5 时，花生油(HS1 3)、山茶油(SC1 3)、葵花籽油(KHZ1 2)、大豆油(DD1 3)和玉米油(YM1 3)分别各自聚为一类;同时，调和油(TH)与花生油(HS1 3)聚为一类，表示该调和油的主要成分可能为花生油。当临界值 10 时，三个产地不同且农户自制的菜籽油(CZ1 3)聚为一类表明了它们之间的相似性。临界值约为 17 时，所有的正常食用油样品都聚为一类。当临界值达到 25 时，非正常食用油与合格食用油分为两大类，表明了正常与非正常食用油的差异性。以上结果表明，指纹图谱结合主成分分析和系统聚类分析，既能比较全面地反映同种食用油谱图之间的相似关系又能反映不同种类食用油谱图之间的差异，分析结果能区别正常与非正常食用油样品。601第 32 卷第 8 期分析试验室Vol.32 No 82013 年 8 月Chinese Journal of Analysis Laboratory2013 8表 218 个食用油样品及 3 个非正常油样品的脂肪酸组成(%)Tab.2The composition of fatty acids in eighteen edible oil samples and 3 mixed samples(%)样品12C16:03C18:14C18:05C18:26C18:27C20:18C20:09C22:010总计DD14.6115.537.145.8811.2225.650000100DD23.7316.8634.195.9614.2924.980000100DD34.1614.539.945.4610.1425.810000100HS13.3414.5451.215.066.4414.410.951.6802.37100HS23.4815.9246.815.057.3216.821.091.402.11100HS33.0116.3349.74.817.6715.050.81.1901.44100SC12.826.7269.933.542.897.962.630.473.050100SC22.426.573.793.263.248.891.320.5800100SC32.657.181.134.241.333.560000100CZ17.768.4948.034.633.275.218.130.6313.850100CZ29.1413.1930.985.482.085.0611.020.6522.410100CZ32.136.5552.363.472.356.086.190.8220.060100YM11.3017.542.621.2611.1125.890.470.3400100YM20.8216.841.952.1510.7226.720.40.4400100YM30.5617.246.771.1810.1923.460.420.2700100KHZ107.8337.363.5721.6729.560000100KHZ209.0538.094.3217.6830.850000100TH2.8713.8155.654.616.3213.771.240.391.330100DG10.4060.6917.095.253.9710.80.830.9700100DG20.8837.2348.174.892.496.0700.2800100DG30.8449.2140.065.381.113.0800.3100100图 5主成分分析结果Fig.5The results of principal component analysis图 621 个食用油样品的系统聚类树系图Fig.6Hierarchicalclusteranalysisof21cookingoil samples701第 32 卷第 8 期分析试验室Vol.32 No 82013 年 8 月Chinese Journal of Analysis Laboratory2013 83结论建立了测定食用油中脂肪酸组成的在线水解甲基化 气相色谱法，采用该法测定了 18 种正常食用油脂及 3 个非正常油脂样品。基于气相色谱图上分离鉴定到的 10 个共有峰的相对强度，建立了 6 类合格食用油的色谱指纹图谱，采用模式识别即主成分分析和聚类分析对所得结果进行区别分析。结果表明合格食用油与非正常油脂样品能得到很好的区别。本法采用了在线衍生化结合 GC 技术，前处理简单，无须使用有机溶剂，且各样品的分析时间只需 30 min。在后继工作中，如能扩大样品量，建立更为全面的食用油指纹图谱库，将为非正常食用油的区别提供更为有效的参考依据。参考文献 1 黄韬睿 四川烹饪高等专科学校学报，2010，4:21 2 朱锐，王督，等 粮食与油脂，2008，11:42 3 刘薇，尹平河，等 中国油脂，2005，(5):24 4 吴静珠，刘 翠 玲，等 北 京 工 商 大 学 学 报，2010，28(5):56 5 张蕊，祖丽亚，樊铁，等中 国 油 脂，2006，31(5):65 6 尹平凤，王桂华，赵玲，等 分析试验室，2004，23(4):8 7 Kossa W C，Macgee J，amachandran S，et alJournal of Chromatographic Science，1979，17:177 8 王鹏，孙杨，等 分析化学，2011，39(9):1427 9 Sun Y，Tang C L，Wu X W，et al Chromatographia，2011，75(7):527 10 朱潘烨，刘东红，等 粮油加工，2008，(6):125 11 李秋怡，宋恬，干 国 平 等中 草 药，2008，39(2):206 12 洪筱坤，王智华 中药数字化色谱指纹图谱 上海科学技术出版社，2003，1 13 刘会君，陈爽，王鹏，等 化学学报，2012，70(1):78 14 Wang L L，Wang C，Pan Z F，et al J Anal ApplPyrol，2011，90(1):13On-line methylation-gas chromatographic determination with pattern recognition analysis for illegalcooking oilsFU Yu-fei，ZHANG Pei-pei，PAN Zai-fa and WANG Li-li*(College of Chemical Engineering and MaterialsScience，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014)，Fenxi Shiyanshi，2013，32(08):103 108Abstract:A method of on-line hydrolysis and methylation-gas chromatography(OHM-GC)was developed for thedetermination of composition of fatty acids in the cooking oils More than 20 cooking oil samples and illegalcooking oil samples were analyzed by OHM-GC using a vertical microfurance pyrolyzer 1 L of(3 mg/mL)oilsample and 2 L of organic alkali，tetramethylammonium hydroxide(TMAH，25%methanol solution)taken ina sample cup was first mounted at the waiting position of the pyrolyzer kept at around room temperature，then itwas dropped into the heated center of the pyrolyzer under the flow of helium carrier gas Thermally assistedhydrolysis and methylation of the samples at 350 in the presence of TMAH allowed analysis of fatty acids astheir corresponding methyl derivatives，and the products formed were introduced into a gas chromatographequipped with a flame ionization detector or mass spectrometer Based on the relative peak areas of 10 peaks inthe chromatogram obtained by OHM-GC，the samples were clearly classified by principle component analysis andhierarchical cluster analysis The fingerprints developed showed a high similarity and a good reproducibility，andthe pattern recognition techniques can distinguish illegal oils from cooking oils well The results proved that itwas a simple，rapid and accurate method，which was suitable for the discrimination of illegal oilsKeywords:Gaschromatography;On-linehydrolysisandmethylation;Principalcomponentanalysis;Hierarchical cluster analysis;Cooking oil;Fatty acids801