胶体金免疫层析法快速检测赭曲霉毒素A研究.pdf

2 0 粮食 与油脂 2 0 1 1 年第 1 0期 胶体金免疫层析法快速检测赭曲霉毒素 A研究 舒文祥，徐炜，李艳，吴文烨，王黎丽，周坚(无锡安迪生物工程有限公司，江苏无锡2 1 4 1 7 4)摘要：该研究应用胶体金免疫层析技术建立一种快速检测食品和饲料 中赭曲霉毒素A方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，标记抗赭曲霉毒素 A单克隆抗体，标记胶体金抗体喷涂 于玻璃纤维上，赭 曲霉毒素 A偶联抗原 O T A-O VA和二抗兔抗 鼠 I g G分别啧涂于硝 酸纤维膜上 作为检测限和质控线，依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装成试纸条并装卡。测试 结果表明，赭曲霉毒素 A快速检测试纸条灵敏度为 5 n g m L，检测时间为 1 0 m i n，批内和批间重复 性为 1 0 0，假 阳性率和假 阴性率均为 0。该法简单方便，非常适于现场快速检测赭 曲霉毒素 A。关键词：赭曲霉毒素 A；胶体金免疫层析；快速检测 1 1 l l -Nt udy On g0 l d i m m unoc nro m at or apI I V as s aY I o r rapi d d e t e c t i o n o f o c h r a t o x i n A、S HU W e n x i a n g，XU W e i，LI Ya n，W U W e n y e，W ANG L i-!i，ZHOU J i a n (Wu x i An t i x B i o t e c h C o ，L t d ，J i a n g s u W u x i 2 1 4 1 7 4，Ch i n a)Abs t r a c t：TO e s t a b l i s h a r a p i d a s s a y f o r d e t e c t i o n o f Oc h r a t o x i n A i n f o o d a n d f e e d，g o l d i mmu n o c h r o ma t o g r a p h y a s s a y wa s s t u d i e d Co l l o i d a l g o l d ma r k e d c o u p l e d wi t h mo n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t 0c h r a t o x i n A wa s j e t s p r a y e d o n t o t h e g l a s s fib e r OT A OVA a n d r a b b i t a n t i-mo u s e i mmu n o g l o b u l i n s wa s j e t p o s i t i o n e d o n t o a n i t r o c e l l u l o s e me mb r a n e S a mp l e p a d，g o l d j e t p a d，n i t r o c e l l u l o s e me mb r a n e a n d a b s o r b e n t P a D e r we r e a s s e mb l e d a n d c u t i n t o d e t e c t i n g c a r d，r e s p e c t i v e l y T h e r e s u l t s h o we d t h a t t h e s e n s i t i v e s t a n d a r d o f r a p i d a s s a y f o r Oc h r a t o x i n A v i s u a l d e t e c t i o n 1 i mi t i S 5 n g mL a n d d e t e c t i o n t i me wi t h i n l 0 mi n Re p e a t a b i l i t y o f s t r i p i s 1 0 0 Th e a s s a y g i v e s n o f a l s e p o s i t i v e a n d f a l s e n e g a t i v e r e s u l t s S o i t i S v e r y s i mp l e a n d c o n v e n i e n t t o r a p i d l y d e t e c t 0c h r a t o x i n A o n t h e s p o t Ke y wo r d s：o c h r a t o x i n A；g o l d i mmu n o c h r o ma t o g r a p h y a s s a y；r a p i d d e t e c t i o n 中图分类号：T S 2 0 7 4 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 8 9 5 7 8(2 0 1 1)1 O 一0 0 2 0 一O 3 赭曲霉毒素(Oc h r a t o x i n)是 曲霉菌属和青霉菌 属产生二级代谢产物，包括赭曲霉毒素 A、B、C、D 和 a等七种结构类似化合物 ；其中赭曲霉毒素 A (O c h r a t o x i n A，O T A)在 自然界分布 最广泛、毒性最 强。赭曲霉毒素 A是一种对肝脏和 肾脏强毒物质，可导致 受试动物 免疫抑制、肾萎缩、胎儿 畸形、流 产及 死亡，并具有高度致癌、致畸、致突变作用 叫；为 此，国际癌症研 究机构 I A R C将其定位 l i b类致 癌 物。加强对 O T A检测是防止被 OT A污染食 品 和饲料直接或间接进入人类食物链重要方法。胶体金免疫层析技术系出现于 2 0世纪 8 0 年代初 期一种免疫分析方法。是在单克隆抗体技术、胶体金 免疫技术和新材料技术基础上发展起来一项 以膜为 固相载体的快速检测技术 、镥 。胶体金快速层析法 因具有特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适于大批 量样品检测，且结果判断直观可靠等优点而越来越被 人们重视和应用。随人们生活水平迅速提高，对食品 安全性也提出更高要求。本研究采用胶体金免疫层析 法快速检测食品中赭曲霉毒素A，取得较为理想结果。1材料与方法 1 1材料 与仪 器 赭曲霉毒素 A标准品：北京标准物质研究中心；抗赭曲霉毒素 A单抗、0 T A 一 0 V A：无锡安迪生物工 程有限公司；氯金酸(H A u C 1 4 3 H2 0)：美国 S i g ma 公 司；柠檬酸三钠、碳酸钾：上海化学试剂公司；硝酸纤 维素膜(NC膜)、玻璃纤维、样品垫、吸水纸：上海金标 生物科技有限公司；试纸条切刀、喷膜仪：上海韩感 电子科技有限公司；紫外分光光度计：上海精密仪器 有限公司；高速冷冻离心机：湖南湘仪离心机有限公 司；磁力加热搅拌器等。1 2实验 方法 1 2 1 胶体金制备 用容量瓶量取 2 0 0 m l 超纯水加入到 5 0 0 ml 锥形 瓶 中，将锥 形瓶 置于磁 力加 热搅 拌器 加热板 上，放入 磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度。用移液器吸 取 2 ml 1 氯金酸溶液于上述 2 0 0 ml 超纯水 中，搅 拌 l mi n，关闭搅拌旋钮，打开加热旋钮，加热至沸腾。打开搅拌旋钮至适当速度，快速加入经微孔滤膜过滤 收稿 日期：2 0 1 卜0 9 0 5 作者简介：舒文祥(1 9 8 0 )，男，硕士，主要从事胶体金快速检测诊断试剂研究。2 0 1 1年第 1 0期 粮食 与油脂 2 1 1 柠檬酸三钠溶液 0 8 ml，溶液在 2分钟内由灰色变 黑色最后变为红色，再继续加热搅拌 1 0 分钟。关掉加 热旋钮，适当速度搅拌至室温，定容至2 0 0 m l，4 C保存。1 2 2胶体金标记 抗体 量 取 3 0 ml 胶体 金置 于 5 0 m1 小烧杯 中，用 0 1 mo l L K2 C O 3 调溶液 p H为 8，磁力搅拌器搅拌均匀，同时加入 3 0 0 g g抗 O T A单克隆抗体继续搅拌 2 0 mi n；缓慢加入 1 0 B S A至终浓度为 1，继续搅拌 3 0 mi n，4 冰箱静置 2 h；将上述胶体金溶液转入 5 0 ml 离心 管中，以 8 0 0 0 r mi n离心 3 0 mi n，小心吸去上清液，沉 淀至 4 C冰箱备用。1 2 3胶体金免疫层析快速检测试纸条组装 取沉淀适当稀释后用喷膜仪在玻璃纤维上喷金 标抗体，1 0 g l c m，3 7 干燥 2 h以上。偶联抗原 O T A BS A用 0 0 1 mo l L p H 7 4 P B S稀 释 至 1 m g mL，用 喷膜仪 喷涂于硝酸纤维膜上，喷量为 1 g l c m，此为 检测 线。在 离 检测 线 上 5 mm处 喷涂 兔 抗 鼠 I g G (1 mg m L)，l g l c m喷量，此为质控线。3 7 干燥 3 0 m i n 以上。将 NC膜、胶 体金垫、样 品垫和 吸水纸依 次组装 在底板上，用切刀切割成 3 9 5 mm宽试纸条装入检测 卡中。1 2 4试 纸条灵敏度测定 将赭曲霉毒素 A标准品用 p H 7 4 0 0 1 M 的 P B S T 溶液配制成浓度为 0 n g、1 n g、2 n g、3 n g、4 n g、5 n g、1 0 n g、5 0 n g mL，分别取 7 0 1 加入到试纸卡检测孔 中，每个浓度重复检测三次，5 1 0 mi n观察结果。1 2 5 试纸条特异性 分别配制赭曲霉毒素 A、黄曲霉毒素 B 1、玉米赤 霉烯酮、桔霉素和展霉素标准 品，浓度分别为 0 n g、5 n g、1 0 n g、5 0 n g、1 0 0 n g mL，用快速检测卡检测，每 个浓度重复三次，判断试纸条特异性。1 2 6试纸条重复性实验 将同批和 3个不同批次试纸条分别检测阴性样品 和 5 n g mL阳性样 品，每个浓度重复 3次，判断试纸 条重复性。1 2 7试 纸条 稳定性实验 将试纸条和干燥剂一起用铝箔袋密闭包装，分 别置 4、室温和 3 7 温箱。放置 4 和室温试纸条 每周各取出 6条，分别用 0 n g mL标准品和 5 n g mL O T A标准品溶液检测试纸条，观察检测线颜色深浅及 N C膜上金标抗体释放程度。置 3 7 C试纸条每天取出 6条，用 0 n g mL标准品和 5 n g m L O T A标准品溶液 检测试纸条，观察检测线颜色深浅及 NC膜上金标抗 体释放程 度。2结果与分析 2 1 胶体金 质量分析 结果 将制 备好 的胶体金经 紫外可见分光光度计在 4 0 0 6 0 0 n m扫描，以超纯水为参比在 5 3 0 n m处有最 大吸收峰，O D 5 3 0=0 9 5 0，见图 1。0 6 0 4 O_2 O 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 波长 n m 图 1 胶体金紫外可见分光光度计扫描图 2 2试纸条灵敏度 0 n g mL阴性样 品检测时，检测线和质控线均出 现较深红 色条带，随着 O T A标 准品浓度增 加，检测线 条带逐渐减弱，当 O T A标准品浓度增至 5 n g mL时，检测线无红色条带出现，至 O T A浓度为 5 0 n g m L时，检测线都不出现红色条带；质控线均出现较深红色条 带(见表 1)。由此可判断该试纸条灵敏度为 5 n g mL。表 1 赭曲霉毒素 A快速检测试纸条灵敏度 赭曲霉毒素浓度 n g mL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 5 0 检钡 0 结果 一 一 一 一 一+注：“一”表示阴性；“+”表示阳性。2-3试纸条特异性 由表 2可知，赭曲霉毒素 A快速检测试纸条与其 它霉菌毒素无交叉反应，只针对 OT A有特异性结合。表 2 试纸条测试赭曲霉毒素 A及其它几种 类似物交叉反应 性 毒素 药剂浓 度 n g mL 赭 曲霉毒素 A T线 C线 黄曲霉毒素 B 1 T线 C线 玉米赤霉烯酮 T线 C线 桔霉素 T线 C线 展青霉 毒素 T线 C线 注：“+”表示出现红色条带；“一”表示未出现红色条带。2 2 粮食 与油脂 2 0 1 1年第 1 0期 2 4重复性和稳定性 实验结果 经验证 OT A快速检测试纸条批 内和批问重复 性为 1 0 0，假 阳性率和假阴性率均为 0。试纸条在 3 7 条件下保存到 1 4天，检测 0 n g mL标准品时检 测 线和质控线显色较 常温 和 4 冰箱 保存试 纸条显色 程度浅，由此可判断，试纸条在3 7 至少可放置 1 3 天，对 检测 结果 无影响。在 4 保存 1 4个月 和室温 保存 1 2个月，检测 0 n g mL标准 品质控线和检测线显色仍 很清 晰，结 合垫 上金 标记 物 释放 完 全，检 测 5 n g mL 标准品时质控线显色清晰，检测线完全抑制，能满足 正常检测要求。最后确定试纸条密封干燥下 4 至少 可保存 1 4个月，室温条件下可保存 一年。3讨论 目前 检 测 O T A 方法 有多 种，主要 包括 薄层 色 谱 法(T L C)、高效液相色谱法(H P L C)、及免疫荧光染色 法、酶联免疫检测等免疫化学方法。我国国家标准检 测 方法 为薄层 色谱 法，它是 目测半 定量 法，最低检 出 量是 1 0 p g k g。而食品添加剂和污染物法典委员会 提出对消费者 O T A膳食摄入量与健康关系进行危险性 评估时，要求所采用检测方法最低检出量小于 5 g g k g，所以薄层色谱法检测数据不能用于计算消费者从膳 食中摄入 OT A量。另外，薄层色谱法也无法进行大 批量样品快速检测。高效色谱法除灵敏度较高外，存 在费时、仪器设备 昂贵、操作复杂且不适合大批量样 品检测 等缺 点。新 发展 免疫 分析 技术在 食 品安全 检 测中最常见的是 E L I S A法和胶体金快速检测试纸法。E L I S A法需借助仪器设备来完成，检测时间较长，不 适于现场快速检测。胶体金免疫层析法由于具有简单 快速、灵敏度高、特异性强、结果直观、无需仪器等特 点，因此可广泛用于医疗诊断及药物检测等领域，而 应用于真菌毒素检测报道较少。本研制 OT A快速检 测试纸条采用竞争原理，样品最低检 出量为 5 g g k g，并在此基础上生产快速检测卡。与其它方法相 比，本 法具有快速、简便、灵敏度高和经济特点，在样品提取 步骤中不需复杂净化过程，可满足食品添加剂和污染 物法典委员会提出对检测方法灵敏度要求。试纸条灵敏度首先取决于胶体金抗体质量，即在 标记过程选择胶体金粒径、标记时 p H值和抗体蛋 白 用量。由于 G I C A中检测信号是 由于金颗粒在检测 限和质控线上聚集而成，所以金颗粒太小就不能产生 足够颜色信号；如果太大又会遇到空间位阻问题，所 以选择合适粒径胶体金会使显色结果易于判断。胶体金粒径一般选 4 0 n m左右，因为随金颗粒增大，灵敏度有提高趋势；但金标抗体稳定性降低。标记时 p H值直接影响标记质量，即抗体与金的偶联，因此必 须选择合适 p H值才能实现金颗粒上抗体标记。抗体 蛋 白用量直接影响试纸条灵敏度，标记抗体过多，需 饱和金标垫上金标抗体的样品检测物质浓度就要升 高；标记抗体过少，则会降低试纸条特异性，因此实验 中选择最佳标记量至关重要。选择 合适溶 液系统，如 重悬 液、T，C线稀释液、样 品垫处理、抗体稀释液也至关重要“”，重悬液如条件 不合适，就会导致在抗体纯化过程中金标抗体聚集，并影响试纸条灵敏度。T线稀释液则会影响包被原在 NC膜上固定；同时溶液系统中加入适量保护剂能改 善显色效果，提高灵敏度。赭曲霉毒素A胶体金试纸条由于具有快速、单份 测定、操作简单、不需添加其它试剂和孵育、洗涤等步 骤优点，因此大大提高检测效率，十分适于现场快速 检测。尽管此法 目前仅只能半定量，但作为一种快速 筛查手段，可有效弥补广大基层单位因设备和经费问 题而无法开展对食品 O T A检测和监控，具有重要经 济价值和社会意义。参考文献 1 孙 亚宁，胡骁飞，邓瑞广，等 赭 曲霉 毒素 A 人工抗原 合成 与 鉴定 J l 生物工程，2 0 1 1，5(3 2)：l 7 2 1 7 5 2Ab a r c a M L，Br a g u l a t M R，Ca s t e l l a G，e t a 1 Oc hr a t o x i n A p r o d uc t i o n b y s t r a i ns of As p e r g i l l u s n i ge r v a r n i g e r Ap p 1 En v i r o n Mi c r o b i ol，1 9 9 4，6 0(7)：2 65 O一 2 65 2 3Fi n k Gr e mme l s J，J a h n A，Bl o m M J，e t a 1 Tox i c i t y a n d me t a b o l i s m o f o c h r a t o x i n A J Na t u r a l T o x i n s，1 9 9 5，3(4)：21 4 2 2 0(4黄彪，张连芬，陶文沂，等 赭曲霉 毒素 A 的高灵敏 度时 间分 辨荧光免疫分析 J _ 生物化学与生物 物理进展，2 0 0 5，3 2(7)：6 6 2 6 6 6 5 褚 庆华，郭德华，王敏，等 谷物和酒类赭 曲霉 毒素 A的测定 J _ 中国国境卫生检疫杂 志，2 0 0 6，2 9(2)：1 O 9 1 1 7 6杨琳，张宇 昊，马 良 高效液 相色谱法 同时检测粮谷 中的黄曲 霉毒素和赭曲霉毒素 J l 食品科学，2 0 1 0，3 1(2 4)：2 5 0 2 5 4 7 宋晓辉，王中立 一种崭新疫病检测 方法免疫层析 与胶体金 J 动物科学与动物医学，2 0 0 3，2 0(5)：5 1 8S hy u R HS h y u H F，Li u H W e t a 1 Co l l o i d a l g ol d ba s e d i mmu n o c h r o ma t o g r a p h i c a s s a y f o r d e t e c t i o n o f r i c i n J _ T o x i c o，2 0 0 2，4 0(3)：2 5 5 2 5 8 9J on e s KTr O ub 1 e s h oo t i n g p r o t e i n b i n di n g i n n i t r o c e l l ul os e me mb r a n e s，p a r t l：p r i n c i p l e s J I V D T e c h n o l o g y，1 9 9 9(5)：3 2 4 1 1 0 3 P e a k S E，Le e S H，Ch o J H，e t a 1 De v e l o p me n t o f r a p i d o n e s t e p i mmu n o c h r o ma t o g r a p h i c a s s a y J Me t h o d s，2 0 0 0，2 2：5 3 6 0 1 1 M c Ewe n S C，Bl a c k W D，e t a 1 An t i b i o t i c r e s i d u e p r e v e n t i o n m e t ho ds，f a r m ma na ge m e nt，a nd oc c ur r e n c e of a nt i b i o t i c r e s i d u e s i n mi l k J Da i r y S c i ，1 9 9 1，7 4：2 1 2 8 2 1 3 7