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人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建
【摘要】 　　目的:克隆人TGFBI基因 ,并构建其真核表达载体。方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区，将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中，进一步通过和Sal I双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI 中。经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了人 TGFBI的编码基因，并成功建了其真核表达载体。结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定。
【关键词】 TGFBI　角膜营养不良　真核表达
　　Cloning of human TGFBI gene and its eukaryotic expression plasmid construction
Abstract AIM: To clone human TGFBI gene and construct its eukaryotic expression plasmid. METHODS: The full coding domain sequence of TGFBI gene was cloned from human corneal tissue from operative spaceman with reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and was sub-cloned into pMD18-T. The targeted DNA fragment, digested with restriction enzyme XbaI and SalI, was directionally cloned into eukaryotic expression plasmid pCI. Then the reconstructed plasmid was identified with PCR, enzyme digestion and sequencing. RESULTS: Human TGFBI gene was successfully amplified and its eukaryotic expression plasmid was constructed. CONCLUSION: The successive reconstruction and verifying of eukaryotic expressive plasmid containing human TGFBI gene established the foundation of studying of the mechanisms of TGFBI gene mutation related corneal dystrophy.
· KEYWORDS: TGFBI; corneal dystrophies; eukaryotic expression
　　0引言
随着分子生物学的研究,近年来人们对角膜营养不良的分子遗传学研究取得了重大进展，已经确定的角膜营养不良基因有TGFBI，CHST6，K3，K12，M1SI，GSN等[1]。同时已经认识到，在中国以TGFBI基因突变导致的角膜营养不良最常见,其多为青春期发病，累及双眼且对称性，病变进展缓慢，导致角膜明显混浊，引起视力下降 。至今为止，该病的致病机制仍不十分清楚。TGFBI基因突变导致的细胞信号传导通路的异常激活是近年来研究的热点，受到越来越多的关注。成功获得人TGFBI基因并构建其真核表达载体是研究角膜营养不良的发病机制的重要物质基础。
1材料和方法
材料 收集2006-01/12在我院行穿透性角膜移植手术供体残留的角膜组织。pCI载体和感受态大肠杆菌JM109由本实验室保存。PMD18-T载体为Takara公司产品。RT-PCR试剂盒和Trizol试剂为Invirogen公司产品;TaqDNA Polymerase,限制性内切酶，DNA marker均为Takara公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为上海华瞬公司产品；T4 连接酶为New England Biolabs 公司产品；Tryptone、Yeast Extract为Oxid 公司产品；氨苄青霉素、IPTG和X-Gal购自哈尔滨宏博生物有限公司。Olig-dT通用引物为上海英俊生物有限公司产品。PCR仪。
　方法 根据GeneBank上报道的人TGFBI序列,利用软件Oligo primer 5辅助设计克隆TGFBI基因的上、下游引物，由上海英俊生物有限公司合成 。上游引物 hTGFBI F：5′TATATGTAGAGCCAGCATGGCGCTCTTC- GTGCG３′,下游引物 Htgfbi R：５′GTGCGTCGACCGTAA- TGCTTCATCCTCTC ３′。上游引物Ｆ的５′端设有 酶切位点，下游引物R的 ５′端设有 Sal I酶切位点。PCR产物为2 089bp。取人角膜缘组织300mg,加入Trizol试剂3mL,匀浆器匀浆。转入DEPC 7mL处理过的EP管,室温放置5min后,4℃，12 000ｇ,离心10min。加入氯仿,用力混匀，室温放置 3min后,4℃,12 000ｇ,离心15min。取上清，加入异丙醇，室温放置10min 后,4℃，12 000ｇ,离心 10min。弃上清，加750g/L乙醇3mL，振荡混匀,4℃,9 000ｇ，离心 5min。弃上清，空气干燥后，加入DEPC 20μL处理水溶解。根据Takara两步法RT-PCR试剂说明，建立反转录体系40μL。向上步总RNA 20μL中，加入 5μL,70℃水浴5min后，立即放在冰上2～3min。继续加入RNA酶抑制剂1μL，5×RT Buffer 8μL，25mmol/L dNTP 4μL， /LDTT 4uL，200kU/L M-MLV 1μL，混匀，37℃水浴3～4h。以反转录产物为模板，建立克隆TGFBI基因PCR反应体系，反应体系为50μL。其中模板1μL，25 mmol/L dNTP 4μL，上、下游引物各2μL，5kU/L ExTag酶μL，10×ExTag Buffer 5μL。反应条件为预变性为95℃5min,94℃60s,52℃60s,72℃90s,35个循环,72℃延伸10min。
　pMD18-T /TGFBI亚克隆的构建 扩增产物电泳,进行 回收,按产品说明书操作。回收产物与pMD18-T载16℃过夜连接，转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含有氨苄青霉素、IPTG和X-Gal LB平板，分别挑取蓝白斑,提取质粒用限制性内切酶和Sal I 进行双酶切鉴定，得到pMD18-T与TGFBI 重组载体。
　pCI/TGFBI真核表达载体的构建 重组的pMD18-T /TGFBI与载体pCI质粒用限制性内切酶 和Sal I 双切割,胶回收后通过T4连接酶进行连接,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,提取质粒分别用双酶切和基因测序鉴定所筛选的阳性克隆。
　　2结果
以人角膜组织基因组中RNA为模板进行两步法RT-PCR扩增TGFBI基因,将产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，在 kb处可见条清晰明亮的目的条带，片断大小与GeneBank中公布的片断大小相等，而阴性对照无目的条带出现(图1)。
重组质粒酶切鉴定 挑选pMD18-T /TGFBI质粒阳性克隆经单切及和Sal I双酶切鉴定。挑选pCI/TGFBI质粒阳性克隆经和Sal I双酶切鉴定, 10g/L琼脂糖凝胶电泳。
图 1 二步法RT-PCR扩增TGFBI基因 1: DNA 标记物；2:2 000bp DNA 标记物 ；3,5:人TGFBI 基因的RT-PCR产物；4:阴性对照
图 2 酶切鉴定重组质粒ｐMD18-T/TGFBI 1: DNA标记物；2:2 000bp DNA标记物；3: Xba I单酶切pMD18-T-hTGFBI重组质粒；4: 和Sal I双酶切pMD18-T-hTGFBI重组质粒
图 3 酶切鉴定重组质粒PCI/TGFBI 1: 单切pCI-hTGFBI重组质粒；2: DNA 标记物
重组质粒序列测定 重组质粒测序结果提交GeneBank 进行Blast 比对， 证实了所克隆的片段正确，且目的片断准确的插入到pCI中的和Sal I多克隆位点中。
3讨论
角膜营养不良是一组原发性、遗传性、双眼性具有病理组织特征改变的疾病,由于正常角膜组织中的细胞在某种基因异常的作用下,使其结构或功能受到进行性损害所致，其共同特点为在角膜组织中形成形态各异的沉淀物，导致患者视力下降。在我国，以TGFBI基因突变相关的颗粒状角膜营养不良和格状角膜营养不良最为常见[2,3]。其中以R124C，R124H，R124L，R555W，R555Q等突变位点最常见，仍有新的不同的突变不断发现。转化生长因子诱导基因(transforming growth factorβ induced gene,TGFBI)是Munier等1997年在培养的接触于TGF-β的人肺腺癌细胞系A549的一个克隆 h3中发现了一个新基因,即命名为TGFBI基因,得到其cDNA序列,并将其定位于人染色体5q31。TGFBI的基因产物是一个68 kDa的蛋白质，称为ｐ68βigh3[2,9], Munier等[2,10]首次将其称为keratoepithelin,即KE(角膜上皮蛋白)。Skonier等研究发现,KE是一个由683个氨基酸组成的蛋白质,包含一个氨基端的分泌前导信号序列和一个位于密码子622～624间的羧基端RGD序列,该序列为Arg(642)-Gly(643)-Asp(644)结构。研究发现，角膜上皮蛋白中的RGD序列能与各种整合素相互作用[2,11]。
正是由于TGFBI基因其编码的68kDa蛋白结构的特殊性，很多科学家把对TGFBI基因突变的研究转入到对其产物蛋白质的研究。有研究认为，碱基的突变可能导致其角膜上皮蛋白中氨基酸的改变，使空间结构的改变导致蛋白质的理化性质或和其它蛋白相互作用发生改变，异常蛋白质沉淀聚集在角膜中。也有研究认为，由于角膜组织没有血管及结构紧密的特殊性，致使其自清能力低，导致角膜混浊，失去透明性。
我们直接通过RT-PCR方法从人角膜移植后的材料中克隆TGFBI全长编码区，比以往通过cDNA文库筛选获得TGFBI编码区简单。通过和Sal I双酶切方法获得两端为粘性末端的外源DNA片段，然后定向、高效插入到克隆和真核表达载体中，简便易行。成功构建含有TGFBI基因的真核表达载体为研究TGFBI基因相关性角膜营养不良提供了充分的依据，为眼科遗传疾病的基础研究奠定了物质基础。
【参考文献】
1袁南荣.全厚植片深板层角膜移植术的临床应用研究.国际眼科杂志,2001;1(4):91-92
2葛红岩,刘平. BIGH3 基因与人角膜营养不良.国际眼科杂志,2006;6(6):1386-1389
3张作明,李莉,郭群,龙潭.颗粒状角膜营养不良一家系报道.国际眼科杂志,2002;2(1):86
4 Dong WL, Zou LH, Pan ZQ, Jin T, Yu J. Molecular genetic study on patients with lattice corneal dystrophy in　YanKe ZaZhi,2005;41(6):523-526
5 Diaper CJ, Schorderet DF, Chaubert P, Munier FL. Clinical and immunopathological corneal phenotype in homozygotes for the BIGH3 R124H mutation. Eye ,2005;19(1):92-96
6 Dighiero P, Drunat S, D‘Hermies F, Renard G, Delpech M, Valleix S. A novel variant of granular corneal dystrophy caused by association of 2 mutations in the TGFBI gene-R124L and DeltaT125-DeltaE126. Arch Ophthalmol ,2000;118(6):814-818
7 Kocak-Altintas AG, Kocak-Midillioglu I, Akarsu AN, Duman S. BIGH3 gene analysis in the differential diagnosis of corneal dystrophies. Cornea ,2001;20(1):64-68
8 Skonier J, Neubauer M, Madisen L, Bennett K, Plowman GD, Purchio AF. cDNA cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta. DNA Cell Biol ,1992;11(7):511-522
9 Skonier J, Bennett K, Rothwell V, Kosowski S, Plowman G, Wallace P, Edelhoff S, Disteche C, Neubauer M, Marquardt　ig-h3: a transforming growth factor-beta-responsive gene encoding a secreted protein that inhibits cell attachment in vitro and suppresses the growth of CHO cells in nude mice. DNA Cell Biol ,1994;13(6):571-584
10 Munier FL, Korvatska E, Djemai A, Le Paslier D, Zografos L, Pescia G, Schorderet DF. Kerato-epithelin mutations in four 5q31-linked corneal dystrophies. Nat Genet ,1997;15(3):247-251
11于洁,邹留河.BIGH3基因与角膜营养不良.国外医学眼科学分册,2002;26(1):54-58