金花茶叶中总黄酮提取及动态变化研究.pdf

2009,Vol.30,No.06食品科学工艺技术72金花茶叶中总黄酮提取及动态变化研究黄永林，文永新*，陈月圆，唐文秀，李典鹏，刘金磊，韦 霄(广西植物研究所，广西 桂林 5 4 1 0 0 6)摘 要：采用单因素及正交试验设计对金花茶叶中总黄酮提取工艺进行了研究，并以芦丁为对照品，采用分光光度法对金花茶中总黄酮动态变化规律进行了研究。结果表明：金花茶叶中总黄酮最佳提取条件为乙醇体积分数7 0%、料液比 1:5 0(g/ml)、提取时间 2.0 h、温度 7 0。1 1 0 月份金花茶叶中总黄酮含量呈波动性上升趋势，1 0月份达到最高。关键词：金花茶；总黄酮；提取工艺；动态变化S t u d y o n t h e E x t r a c t i o n T e c h n o l o g y a n d D y n a m i c C h a n g e o f F l a v o n o i d s i n C a m e l l i a n i t i d s s i m a L e a v e sHU A NG Y o n g-l i n，WE N Y o n g-x i n*，C H E N Y u e-y u a n，T A NG We n-x i u，L I Di a n-p e n g，L I U J i n-l e i，WE I X i a o(G u a n g x i I n s t i t u t e o f B o t a n y,G u i l i n 5 4 1 0 0 6,C h i n a)Ab s t r a c t ：B a s e d o n t h e r e s u l t s o f s i n g l e f a c t o r,o r t h o g o n a l t e s t d e s i g n w a s a d o p t e d t o o p t i m i z e t h e e x t r a c t i o n t e c h n o l o g y o ft o t a l f l a v o n o i d s i n C a m e l l i a n i t i d s s i m a l e a v e s.Wi t h r u t i n a s r e f e r e n c e m a t e r i a l,t h e d y n a m i c c h a n g e l a w o f c o n t e n t o f t o t a l f l a v o n o i d si n C a m e l l i a n i t i d s s i m a l e a v e w a s a n a l y z e d u s i n g s p e c t r o p h o t o m e t r y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o p t i m a l e x t r a c t i o n c o n d i t i o n sa r e:u s i n g 7 0%e t h a n o l a s e x t r a c t a n t,r a t i o o f m a t e r i a l t o s o l u t i o n 1:5 0 (W/V),e x t r a c t i o n t i m e 2.0 h,e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e 7 0 .T h e c o n t e n t o f t o t a l f l a v o n o i d s i n C a m e l l i a n i t i d s s i m a i n c r e a s e s f l u c t u a t i n g l y f r o m J a n u a r y t o O c t o b e r,r e a c h i n g t h e h i g h e s t a tO c t o b e r.Ke y wo r d s：C a me l l i a n i t i d s s i ma；t o t a l f l a v o n o i d s；e x t r a c t i o n t e c h n o l o g y；d y n a mi c c h a n g e中图分类号：T S 2 0 1.2 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 2-6 6 3 0(2 0 0 9)0 6-0 0 7 2-0 4收稿日期：2 0 0 8-0 5-2 7基金项目：广西壮族自治区基金项目(桂科基 0 6 3 9 0 4 7)；国家基金面上项目(3 0 5 6 0 0 1 5)；广西壮族自治区科技攻关项目(桂科攻0 7 1 8 0 0 2-3-7)作者简介：黄永林(1 9 7 4-)，男，助理研究员，学士，主要从事植物化学与药学研究。E-ma i l：h y l g x i b.c n*通讯作者：文永新(1 9 5 3-)，男，研究员，主要从事天然产物开发利用研究。E-ma i l：w y x g x i b.c n金花茶(C a me l l i a n i t i d s s i ma)属于山茶科山茶属植物，是世界最珍贵的植物品种之一，有植物界的“大熊猫”、“茶花皇后”之美誉 1。金花茶富含有重要保健价值的微量元素、氨基酸及茶皂甙、黄酮类等多种生理活性成分 2-4，具有清热解毒、利尿利湿等功效，常用于咽喉炎、痢疾、水肿、高血压、肿瘤等疾病的治疗。临床验证表明，金花茶叶具有抑制肿瘤、抑菌、抗衰老、增强机体免疫、平行人体各种机能、增强心肌收缩力和血管弹性、增进肝脏代谢、降低胆固醇、降血压、激活人体各种酶等作用 5-8，是广西极具开发价值的特色资源优势植物 9。植物类黄酮在植物中分布广泛，随着研究的深入黄酮类成分在医药领域的应用取得了良好的社会效益和经济效益，如银杏黄酮、葛根黄酮在医药领域的广泛应用 1 0-1 1。迄今有关金花茶黄酮类化合物的提取及动态变化方面的研究尚未见报道，为充分开发利用这一植物资源，本实验对金花茶叶中总黄酮的提取及动态变化进行研究，通过数据分析，确定最佳提取条件，掌握金花茶叶中总共酮动态变化规律，为进一步开发利用这一资源提供科学依据。1材料与方法1.1材料与试剂金花茶叶于2 0 0 7 年采自广西植物研究所金花茶种植基地，阴干后，置于 6 0 烘箱中干燥，粉碎过 6 0目筛，备 用。芦丁对照品 中国药品生物制品检定所；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为 AR级。1.2仪器与设备T 6 新世纪紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；瑞士 P r e c i s a B a i l n c e s S e r i e s X S 电子天平73工艺技术食品科学2009,Vol.30,No.06P r e c i s a 仪器有限公司；HH-5 型水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；G D 6 5-1 型干燥箱 北京市朝阳区来广营医疗器械厂。1.3方法1.3.1对照品溶液的制备精密称取在 1 2 0 下干燥至恒重的芦丁对照品 2 0.0m g 置于 1 0 0 ml 容量瓶中，加7 0%乙醇7 0 ml 置水浴上微热使其溶解，放冷至室温，加 7 0%乙醇至刻度，摇匀，即得 0.2 mg/ml 对照品溶液，待用。1.3.2标准曲线的制备 1 2-1 3 分别取上述对照品溶液 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 m l 置于2 5 m l 容量瓶中，加5 0%乙醇至1 0 m l，先加5%亚硝酸钠溶液 1 ml，使混匀，放置 6 mi n；加 1 0%硝酸铝溶液 1 ml，摇匀，放置 6 mi n；加 4%氢氧化钠溶液1 0 ml，再加 5 0%乙醇至刻度，摇匀，分别得空白液及含 0.0 0 8、0.0 1 6、0.0 3 2、0.0 4 8、0.0 6 4 mg/ml 对照品的溶液，放置 1 5 mi n 后在5 1 0 n m波长处测定吸光度，以芦丁含量(mg/ml)为纵坐标，吸光度为横坐标作标准曲线，所得标准曲线为：C 0.0 8 2 1 A 0.0 0 0 8(R2=0.9 9 9 4)。1.3.3供试品溶液的制备精密称取金花茶叶干品(过6 0 目筛)1 g 至1 0 0 m l 烧瓶中，加入一定体积分数的乙醇溶液，冷浸3 0 mi n 后，在一定温度下浸提 2.0 h，放冷至室温，过滤，滤液至1 0 0 m l容量瓶中定容，摇匀，作供试品溶液，待用。1.3.4供试品含量的测定精密吸取供试品溶液 0.0、1.0 ml，置于 2 5 ml 容量瓶中，分别加 5 0%乙醇至 1 0 ml，先加 5%亚硝酸钠溶液 1 ml，使混匀，放置 6 mi n；加 1 0%硝酸铝溶液 1 ml，摇匀，放置 6 m i n；加4%氢氧化钠溶液 1 0 m l，再加5 0%乙醇至刻度，摇匀，放置 1 5 mi n 后，以加入 0.0 ml 供试品溶液为空白液，在 5 1 0 n m波长处测定吸光度。1.3.5单因素试验 1 3-1 4 精密称取金花茶叶干品(过6 0 目筛)1 g 至1 0 0 m l 烧瓶中，分别考察料液比、乙醇体积分数、温度、提取时间四因素对多花茶叶中总黄酮提取量的影响。1.3.6正交试验在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度为考察因素，以测得的总黄酮提取量为考察指标，选用 L9(34)正交试验对金花茶叶中总黄酮的提取工艺进行研究。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1乙醇浓度对总黄酮提取的影响分别用不同浓度的乙醇溶液浸泡相同量的样品2 4 h，测定总黄酮的提取量，结果见表 1。乙醇浓度(%)3 04 05 06 07 08 0总黄酮提取量(%)1.6 01.9 82.1 32.5 8 62.6 6 7 2.6 5 3表1 乙醇浓度对提取的影响Table 1 Effects of ethanol concentration on extraction yield oftotal flavonoids结果表明，随着乙醇浓度的提高，总黄酮提取量不断增加，乙醇浓度提高到 8 0%后，黄酮类化合物溶解度反而减少，可能是一些脂溶性物质、色素等成分的溶出量增加后不利于黄酮类化合物的溶出，使测量结果偏低，因此选用 7 0%乙醇作为提取溶剂。2.1.2提取时间对总黄酮提取的影响在物料比1:5 0(g/ml)、7 0%乙醇浓度下，同一样品称取 5 份，分别提取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察提取时间对总黄酮提取的影响，结果见表 2。结果表明，从金花茶叶中提取总黄酮的最佳时间为 2.0 h 左右，当提取时间再增加时总黄酮的提取量增加不是很明显，提取 2 h 后，再通过增加提取时间来提高总黄酮的提取量意义不大。提取时间(h)1.01.52.02.53.0总黄酮提取量(%)2.0 2 62.4 3 42.5 3 02.5 4 22.5 6 0表2 提取时间对提取的影响Table 2 Effects of time on extraction yield of total flavonoids2.1.3料液比对总黄酮提取的影响在乙醇浓度为 7 0%、温度 7 0、提取时间为 2.0 h的条件下，考察料液比对提取总黄酮的影响。从表 3 可以看出，随着料液比的增大，提取量逐渐增大，但到一定程度后，又有所下降，因此提取最适料液比为1:4 0(g/ml)。料液比(g/m l)1:1 01:2 01:3 01:4 01:5 0总黄酮提取量(%)2.2 8 32.3 3 62.4 8 52.5 5 62.4 3 2表3 料液比对提取的影响Table 3 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of totalflavonoids2.1.4提取温度对总黄酮提取的影响提取温度()4 05 06 07 08 0总黄酮提取量(%)2.2 8 72.3 6 82.5 3 22.5 5 22.5 5 6表4 提取温度对提取的影响Table 4 Effects of temperature on extraction yield of totalflavonoids在乙醇浓度为7 0%、料液比为1:4 0(g/ml)、提取温度分别为 4 0、5 0、6 0、7 0、8 0 的条件下提取 2.0 h，2009,Vol.30,No.06食品科学工艺技术74实验号金花茶叶中黄酮提取量(%)R S D(%)平均提取量(%)13.4 223.3 933.3 61.8 03.4 343.4 853.5 1表1 0 验证实验Table 10 Results verification experiments of optimized extractiontechnology of total flavonoids考察提取温度对总黄酮提取量的影响。从表 4 可知，随着提取温度的提高，总黄酮的提取量增加，当提取温度达到 7 0 以后，再增加温度时黄酮的提取量增加很少，因此选用 7 0 作为提取温度。2.1.5正交试验在以上的单因素试验中，各因素对总黄酮提取的影响不是绝对独立的，而是各因素之间存在相互影响，为获取最佳的提取工艺，在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度为四因素，选取三水平进行正交试验设计，因素水平表见表 5，正交设计及结果分析见表 6。水平 A乙醇浓度(%)B提取时间(h)C料液比(g/m l)D提取温度()16 01.51:3 06 027 02.01:4 07 038 02.51:5 08 0表5 L9(34)正交试验因素水平表Table 5 Factors and levels of orthogonal test L9(34)on extractiontechnology of total flavonoids试验号 因素总黄酮提取量(%)ABCD111112.2 3212222.4 5313332.4 8421232.8 2522312.8 1623122.7 6731322.6 7832132.5 0933212.4 2K12.3 92.5 72.5 02.4 9K22.8 02.5 92.5 62.6 3K32.5 32.5 52.6 52.6 0R0.4 10.0 40.1 50.1 4表6 正交试验结果Table 6 Results of orthogonal test on extraction technology oftotal flavonoids从表 6极差分析的结果可知，乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度四因素对总黄酮提取量影响的主次顺序为乙醇体积分数料液比提取温度提取时间，并且最佳提取工艺条件为乙醇浓度 7 0%、提取时间 2.0 h、料液比 1:5 0(g/ml)、提取温度 7 0，即A2B2C3D2。2.2提取次数的确定在上述最佳条件下，进行不同提取次数实验，结果见表 7。由表 7可知，随着提取次数的增多，总黄酮的提取量不断增大，但是，提取 2 次后总黄酮的增加量不明显。因此从节约成本的角度考虑，选取浸提 2 次为最佳。提取次数(次)12345总黄酮提取量(%)3.1 53.3 93.4 03.4 33.4 5表7 提取次数对提取的影响Table 7 Effects of extraction times on extraction yield of totalflavonoids2.3总黄酮稳定性的考察将供试品溶液显色后，放置 9 0 i n，每隔 1 5 mi n测定一次吸光度，结果见表8。由表8 可知，在1 5 9 0 m i n范围内，其吸光度变化小于 4%，特别是在前 4 5 mi n 内基本无变化，说明金花茶叶总黄酮在该方法下检测稳定性较好。放置时间(m i n)1 53 04 56 07 59 0吸光度0.2 9 80.2 9 70.2 9 50.2 9 10.2 8 90.2 8 6表8 总黄酮稳定性测定Table 8 Stability of content determination of total flavonoids2.4回收实验在已知样品中定量加入对照品，按供试品溶液制备方法制备及检测总黄酮量。结果表明，5 个样品的回收率均在9 8%以上(9 8.6%1 0 2.7%)，平均回收率为1 0 0.2%，回收率较高(表 9)。样品样品中加入芦丁测得回收率平均回收率号黄酮量(mg)量(mg)量(mg)(%)(%)11.2 6 51.0 0 22.2 6 19 9.721.2 6 51.0 0 22.2 3 59 8.631.2 6 51.0 0 22.3 2 81 0 2.71 0 0.241.2 6 51.0 0 22.2 7 31 0 0.351.2 6 51.0 0 22.2 4 39 8.8表9 总黄酮回收率实验结果Table 9 Results of recovery experiments2.5验证实验为考察上述优选提取工艺的稳定性，按该工艺条件进行重复性实验，分别测定并计算金花茶叶中总黄酮提取量，结果见表 1 0，测定的结果均优于正交试验表中的任何一组，且 R S D为 1.8 0%，说明该工艺稳定可行。2.6不同采收期金花茶叶中总黄酮含量检测75工艺技术食品科学2009,Vol.30,No.06 精密称取不同采收期金花茶叶干品(过6 0 目筛)1 g，按正交试验确定的最佳工艺条件制备供试品溶液(提取两次)。结果(图 1)表明，1 1 0 月金花茶叶中总黄酮含呈波动性上升趋势，1 0 月份达到最高，1 1 月后迅速下降。图1 不同采收期总黄酮含量变化Fig.1 Changes of content of total flavonoids in different growthperiods54.543.532.521.510.50总黄酮含量(%)月份1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 11 2参考文献：1 傅立国.中国植物红皮书稀有濒危植物:第一册 M.北京:科学出版社,1 9 9 2.2 陈即惠,吴树荣,赖德禄.人工无性繁殖金花茶叶微量元素及其保健作用 C /防城金花茶国际学术会议论文集,1 9 9 4:2 5 1-2 5 5.3 黄燮才.金花茶开发利用概况及前景预测 J .中国中医药信息杂志,1 9 9 4,1(6):1 0-1 1.4 梁机,杨振德,卢天玲,等.从茶多酚及氨基酸含量比较8 种金花茶制茶适宜性 J .广西科学,1 9 9 9,6(1):7 2-7 4.5 黄燮才.广西药用植物补给补遗 J .广西科学,1 9 9 9,6(1):7 5.6 王知登,熊永革.油茶皂甙对血清胆固醇浓度的影响 J .贵州医药,1 9 8 8,1 2(4):2 2 2-2 2 4.7 H O N G C Y,WA N G C P,L O Y C,e t a l.E f f e c t o f f l a v a n-3-t a n n i n sp u r i f e d f r o m C a m e l l i a s i n e n s i s o n l i p d a t i o n o f r a t h e a r t m i t o c h o n d r i a J .A m J C h i n Me d,1 9 9 4,2 2(4):2 8 5.8 G O ME S A,V E F A S I R MI N J R,D A S M,e t,a l.A n t i-h y p e r g l y c e m i c e f f e c to f b l a c k t e a C a m e l l i a s i n e n s i s i n r a t J .J E t h n o p h a r m a c o l,1 9 9 5,4 5(3):2 2 3-2 2 6.9 苏宗明.广西资源植物开发利用的前景 J .广西科学院学报,1 9 9 4,1 0(1):1 9-2 0.1 0 王德伟,朱红,高尔.银杏黄酮的药理作用和临床应用 J .食品与药品,2 0 0 6,8(6):7-9.1 1 张宁,马建芳.葛根素的临床应用 J .海峡药学,2 0 0 3,1 5(5):9 3-9 5.1 2 黄永林,赵志国,文永新.不同部位艾枘香中总黄酮的含量测定 J .广西植物,2 0 0 6,2 7(4):4 5 3-4 5 5.1 3 李长生,朱笃,邓娟,等.鸭儿芹总黄酮提取及含量测定 J .食品科学,2 0 0 6,2 7(1 1):3 5 7-3 6 0.1 4 钱剑林.白沙枇杷叶黄酮类物质提取工艺的研究 J .食品科学,2 0 0 7,2 8(7):2 5 2-2 5 4.1 5 A N G U S M,WE N D Y A P,L I N C O L N T.R e g u l a t i o n o f a u x i n t r a n s p o r tb y a m i n o p e p t i d a s e s a n d e n d o g e n o u s f l a v o n o i d s J .P l a n t a,2 0 0 0,2 1 1(3):3 1 5-3 2 4 1 6 C A R O L Y N E L,J A N E E L,J O H N R L W.D e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i ne n z y m e s o f f l a v o n o i d b i o s y n t h e s i s i n t h e s k i n s o f r e d a n d g r e e n a p p l ec u h i v a r s J .J S c i F o o d A g r i c,1 9 9 6,7 1:3 1 3-3 2 0 1 7 程水源,顾曼如,束怀瑞.影响银杏叶黄酮含量的因子及其评价 J .西北林学院学报,2 0 0 1,1 6(2):7 5-7 9.3结论与讨论3.1本实验通过正交试验法对金花茶的提取工艺条件进行了研究，确定了金花茶叶中总黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓度 7 0%，提取时间 2.0 h，料液比 1:5 0(g/ml)，提取温度 7 0，提取次数 2次。并按最佳工艺进行了验证实验，结果均优于正交试验表中的任何一组，且R S D为 1.8 0%，说明该工艺稳定可行。3.2对不同采收期金花茶叶中总黄酮含量分析的结果可为最大限度利用金花茶叶中总黄酮资源提供科学依据。但是，黄酮在植物体内合成、转化、降解是一个复杂的过程，受多种因素的影响。在合成过程中，即有生长激素 1 5 和酶 1 6 的参与，又受光合产物和合成前体物质制约 1 7，同时还伴随着转化和降解产生，所以黄酮类化合物是如何调节和控制金花茶生长发育，促进繁育是一个复杂的过程，还有待进一步的深入研究。