人胰高血糖素样肽.docx
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1、人胰高血糖素样肽【摘要】 目的:对人胰高血糖素样肽-1进行基因突变,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/hGLP-1,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:选择大肠杆菌偏爱密码子,将hGLP-1第2位的丙氨酸定点突变为缬氨酸,直接生物合成4个寡聚核苷酸片段并进行基因拼接,形成完整的hGLP-1突变体基因hGLP-1,并连接到载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,BamH I与Xho I双酶切电泳鉴定与序列测定,然后诱导表达其融合蛋白。结果:经酶切电泳鉴定与测序分析,证实所合成的突变体基因hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中,经SDS-PAGE分析可以诱导表达出融合蛋白。结论:成功
2、地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/hGLP-1,为进一步获得重组hGLP-1蛋白奠定基础,为产业化规模制备hGLP-1突变体提供实验依据。【关键词】 人胰高血糖素样肽-1;融合蛋白;基因突变;克隆;糖尿病 Construction of expression vector of human Glucagon-like peptide-1 mutant gene Abstract Objective: To obtain the mutant gene of human Glucagon-like peptide-1(hGLP-1),construct the expressio
3、n vector of pGEX-4T/hGLP-1,and express the GST fusion protein incells. Methods: With the preferential codon ofbeing selected, four oligonucleotide fragments were directly biosynthesized, then were spliced to form a complete mutant gene of hGLP-1 which changed the codon for the second amino acid of h
4、GLP-1(737)-alanine (Ala8) into valine (Val8) by means of site-directed mutagenesis, so it namedhGLP-1. The mutant gene was inserted into the vector pGEX-4T-1 with BamH I and Xho I restrictionrecombinant plasmid of pGEX-4T/hGLP-1 was transformed into E. coli cells(BL21),then identified by electrophor
5、esis after enzyme digestion and testified by DNA sequencing, further induced to express the fusion protein by IPTG. Results: The results of electrophoretic analysis and DNA sequencing confirmed that the synthetic mutant gene (Val8) hGLP-1 had been cloned into the pGEX-4T-1 successfully, and induced
6、expression of fusion protein by SDS-PAGE analysis. Conclusion: The GST fusion protein expression plasmid of pGEX-4T / (Val8) hGLP-1 was successfully constructed,which laid the foundation for further obtaining recombinant hGLP-1 mutant for experimental or clinical studies and provided the technical r
7、outes of industrialization. Key words Human Glucagon-like peptide-1; Fusion protein; Gene mutation; Cloning; Diabetes mellitus 人胰高血糖素样肽1是由人胰高血糖素基因编码、并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素,它是随着食物在肠道的消化吸收过程而分泌的,其功能由hGLP-1受体(hGLP-1R)介导,是目前能诱导胰岛素分泌的最强物质之一,还能以同样的强度抑制胰高血糖素的分泌,它促胰岛素分泌的作用具有葡萄糖依赖性,随着葡萄糖浓度降低,其促胰岛素分泌作用逐渐减弱,因而hGLP-1
8、降糖作用是自限性的,不会增加2型糖尿病患者发生低血糖的危险性,这是hGLP-1优于磺酰脲类降糖药及胰岛素最显着的特点1,2。另外研究发现GLP-1具有改善胰腺B细胞及胰岛功能、增加胰岛素敏感性、抑制胃排空、影响葡萄糖代谢等多种生物学作用3,4,对机体的葡萄糖稳态调节起着十分重要的作用,因而hGLP-1对于2型糖尿病的治疗具有很高的临床应用价值。但是GLP-1的不足之处是半衰期很短,皮下注射后很快被1种特异性的蛋白酶二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)降解而失去生物活性,从而限制了GLP-1的临床应用。因此目前的研究热点是寻找能抵抗DPP-IV降解的hGLP
9、-1类似物或DPP-IV的特异抑制剂。本研究选择hGLP-1第2位的丙氨酸作为突变位点,生物合成其突变体基因,构建hGLP-1突变体的表达载体,为下一步获取重组hGLP-1蛋白创造条件,使其能抵抗DPP-IV的降解,延长其生物半衰期,为开发理想的降糖多肽类药奠定基础。 1 材料与方法 材料 大肠杆菌BL21由本实验室保存,pGEX-4T-1为Amarsham公司产品,限制性内切酶BamH I与Xho I、DL-2000 DNA Marker、DNA/Hind Marker 均为TaKaRa公司产品, T4 DNA连接酶和琼脂糖为Promega公司产品,质粒抽提试剂盒为TIANGEN公司产品,预
10、染蛋白Marker为上海Biolabs公司产品。方法hGLP-1突变体cDNA序列设计与合成 参照文献并加以改进,以缬氨酸取代hGLP-1 N端第二位丙氨酸(Ala8),根据其氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成待重组的含第二位点突变(Val8)密码子的hGLP-1 cDNA序列。设计合成4个寡聚核苷酸片段,由英骏生物技术有限公司合成,其长度分别为:F1:54 nt;F2:54 nt;F3:58 nt;F4:50 nt;合成基因总长度为112 bp;包括位于5端BamH I和3端Xho I酶切位点;两个终止密码子TGA 和TAA;在GST与hGLP-1编码序列之间加入溴化氰裂解位点
11、蛋氨酸密码子ATG。hGLP-1突变体cDNA序列设计 F1:5-GATCCATGCACGTAGAAGGTACCTTCACCT-CTGACGTATCCTCTTACCTGGAAG-3 F2: 5-GCCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGCTTGG-CTGGTTAAAGGCCGTGGTTGATAAC-3 F3: 5-AGCCTGGCCTTCCAGGTAAGAGGATACGT-CAGAGGTGAAGGTACCTTCTACGTGCATG-3 F4: 5-TCGAGTTATCAACCACGGCCTTTAACCAGC-CAAGCGATGAATTCTTTAGC-3 目的基因hGLP-1的获得寡聚核苷
12、酸的复性 分别将合成的四个寡聚核苷酸链F1、F2、F3、F4用TE溶解。分别将等摩尔的F1与F3,F2与F4进行两两复性,并使之终浓度为1 pmol/l,复性总体系均为20 l。复性条件均为90 5 min、65 10 min后静置冷却至室温;双链片段的拼接:取复性好的F1F3、F2F4双链按如下体系混合各溶液:F1F3 3 l,F2F4 3 l ,2DNA连接酶buffer 10 l,T4 DNA连接酶2 l,ddH2O 2 l,总体系20 l;37水浴孵育34 h。然后行2%琼脂糖凝胶电泳检测。原核表达质粒pGEX-4T/hGLP-1的构建 用BamH I和Xho I对原核表达载体PGEX
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