基因工程中常用的工具酶样本模板.doc

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第二章 基因工程中常见的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割
DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化
核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接
核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰
其它酶类--用于生物细胞的破壁、 转化、 核酸纯化、 检测等。
§2-1 核酸内切限制酶
定义: 核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

到当前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能( 图)

一 、 限制修饰系统的种类( 图)

二、 限制性内切酶的定义、 命名
1. 定义: 广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指II型限制酶。
2. 命名: 限制酶由三部分构成, 即菌种名、 菌系编号、 分离顺序。
例如: HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae, ”ｄ”表示菌系为ｄ型血清型; ”Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ
SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
三、 Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点
a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列, 但它们的切割作用却是随机的, 在距特异性位点至少1000bp的地方能够随机地切割DNA分子, 因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割
b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点切割
c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶, 在切割反应过程中, 都会沿着DNA分子移动, 因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应
d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶, 一般都是大型的多亚基的复合物, 既具有内切酶活性, 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性
四、 Ⅱ型核酸内切限制酶的特点
(1)基本特点:
① 在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列, 即所谓的识别序列, 并由此切割DNA分子形成链的断裂; ——识别序列
② 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布, 一般不是彼此直接相正确; ——单链切割部位
③ 因此, 断裂的结果形成的DNA片段, 也往往具有互补的单链延伸末端
④ 此类型核酸内切限制酶比较简单, 不需要能量分子ATP, 但需加入Mg++离子, 而且是从其识别序列内部切割DNA分子
⑤ 在结构上是一种单一的成分, 即与Ⅰ型Ⅲ型酶不同, 不具有多种亚基成分;
(2)识别位点又称切割位点、 识别序列或靶子序列。绝大多数Ⅱ型核酸内切限制酶都能够识别由4、 5、 6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI识别的序列是GAATTC, 我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。呈典型的旋转对称型回文结构
(3)平末端与粘性末端
由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用, 一般有下列两种不同的方式:
两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心, 结果形成——具平末端的DNA片段。Blunt ends
两条链上的断裂位置是交错地、 但又是对称地围绕着一个对轴排列, 结果形成——具粘性末端的DNA片段。Cohesive ends
粘性末端概念(定义): ( 图)
*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构, 它们能够经过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。
(4)限制酶的识别序列与切割频率
具4个核苷酸组成的识别序列的限制酶如Sau3A的切割频率为44=256
具由6个核苷酸组成的识别序列的限制酶如BanHI的切割频率为46=4096
以上假定条件是, 在一条随机排列的DNA序列中, 假定所有的4种核苷酸都有同等出现的频率, 那么任何一种4核苷酸或6核苷酸的识别靶子都有上述的出现频率。
(5)同裂酶(isoschizomers)
识别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶。例如HpaI和MspI就是一对同裂酶。同裂酶形成同样的末端。有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别, 可用来研究DNA甲基化作用。
(6)同尾酶(isocaudamers)
一些来源不同、 识别的靶子序列也各不相同, 但却能产生出相同的粘性末端, 特称为同尾酶。例如BamHI、 BglⅡ、 Sau3A等即是一组同尾酶。
BamHI GGATCC
BglⅡ AGATCT
Sau3A GATC
*同尾酶在基因克隆中有用处, 举例说明:

但产生的重组体中原识别位点发生了变化。
(7)识别多核苷酸序列的酶
例如HindⅡ就是能够识别多种核苷酸序列的一种核酸内切限制酶:
5¢-CTPyPuAC-3¢
其Py=嘧啶碱基C或T; Pu=表示嘌呤碱基A或G
五、 影响核酸内切酶活性的因素
(1)DNA的分子特性
a.限制酶识别位点周围的碱基成分
b.特定DNA分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度。

c.完全消化超盘旋的DNA要比完全消化等量的线性DNA需消耗更多的限制酶。

d.DNA的甲基化程度

完全切割不同来源的DNA样品所需的限制酶单位( 图)
(2)酶切消化反应温度
a.最适酶切消化温度
不同的核酸内切限制酶的最适的消化温度是不同的。酶切温度高于或低于最适温度, 都会影响限制酶活性, 甚至失活。

b.限制酶的星号活力
限制酶的星号活力是指在酶反应条件发生改变(变更)的情况下, 该酶便失去了识别其固有的特异序列(识别位点)的能力, 而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。

(3)DNA纯度
酶切反应体系中的一些试剂成分, 会改变限制酶的切割特性。因此DNA制剂的纯度对酶的活性会有很大的影响

六、 核酸内切限制酶对DNA的消化作用
应用X射线晶体学技术, 测定限制酶－DNA复合物的分子结构的研究, 指出Ⅱ型核酸内切酶, 是以同型二聚体形式与靶DNA序列发生作用, 以EcoR Ⅰ为例, 它是以同型二聚体上的6个氨基酸( 每个亚基各有一个Glu和2个Arg残基) , 同识别序列上的嘌呤残基形成12个氢键的形式, 而结合到靶DNA识别序列并从此发生链的切割反应。

§2.2 DNA连接酶
定义: 能催化两个DNA片段末端之间-P和-OH基团形成磷酸二酯键, 使两个末端连接的酶称为DNA连接酶( DNA ligase) 。
当前已经知道有四种方法能够在体外将DNA片段连接起来:
a.用DNA连接酶将具有互补粘性末端的片段连接起来
b.用T4 DNA连接酶将平末端的DNA片段连接起来
c.先在DNA片段两端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴, 然后用DNA连接酶将之连接起来。
d.先在DNA片段两端加上化学合成的衔接物或接头, 使之形成粘性末端, 然后再用DNA连接酶将之连接起来。
一、 连接条件:
a.DNA连接酶要求在一条DNA链的3¢-末端具有一个游离的羟基(-OH)和另一条DNA链的5¢-末端具有一个磷酸基团(P), 才能发挥其连接作用;
b.由于在-OH和-P基团之间形成磷酸二酯键是一种需能的过程(反应), 因此需要能源分子的存在才能实现连接反应。
在大肠杆菌细胞中连接酶催化的连接能源是:
NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]
在动物细胞和噬菌体中, 连接酶催化的连接能源是: ATP[腺苷三磷酸]

二、 最佳连接温度
理论上连接酶体外最佳连接温度是37℃, 但在此温度下, 粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此实际上的最佳连接温度应是界于酶作用速率和末端结合速率之间, 一般经验认为是4～15℃比较合适。
三、 DNA连接酶的反应条件( 图)

四、 末端DNA片段的连接过程 ( 图)

§2.3 DNA 聚合酶
常见聚合酶: 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 、 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、 T4 DNA聚合酶、 T7 DNA聚合酶、 修饰的T7DNA聚合酶、 反转录酶等。
共同特点: 都能够把将脱氧核糖核苷酸连续地加到引物链的3`-OH末端, 催化核苷酸聚合, 而不发生从引物模板上解离的情况。

但大多数聚合能力差, 参入不到10个核苷酸, 就从引物模版解离下来: 大肠杆菌DNA聚合酶、 Klenow酶、 T4 DNA聚合酶。
参入数百个核苷酸: T7 DNA聚合酶

一、 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 性质:
5`－3`聚合酶活性; 5`－3`外切酶活性; 3` －5`外切酶活性
聚合作用发生在引物链3`-OH末端同参入的核苷酸之间, 当这个外源核苷酸参入之后, 又提供一个新的3`－OH, 因此, 聚合酶催化的链的合成是按5`－3`方向生长
当反应物中缺乏dNTPs, 表现出3` －5`外切酶活性, 将从游离的3`-OH末端逐渐的降解单链及双链DNA。

2.DNA缺口转移与探针的制备
在分子克隆中的主要用途: 经过缺口转移, 制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。
原理: 5`－3`外切酶活性从缺口的5`一侧移去一个5`核苷酸, 聚合作用就在3`一侧补上一个新的核苷酸。可是聚合酶不能够在3`-OH和5`-P之间形成键, 因此随着反应的进行, 5`-侧核苷酸被不断的移去, 3`一侧核苷酸又按序的补加, 于是缺口沿着DNA分子合成的方向移动。——缺口转移

探针制备( 图)
反应体系: 特定的DNA; DNaseⅠ; PolⅠ; 32P－dNTPs
二、 Klenow酶
来源: 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶, 经枯草杆菌蛋白酶处理之后, 产生出来分子量为76×103dal的大分子
功能: 5`-3`聚合酶活性; 3`-5`外切酶活性
用途: 修补经限制酶消化形成的3`隐蔽末端

标记DNA片段的末端
cDNA克隆中的第二链cDNA的合成

DNA序列测定

缺点: 不能够有效的标记带有3`突出的DNA末端。
同位素标记DNA片段的末端( 图)

三、 T4 DNA聚合酶
来源: T4噬菌体感染的大肠肝菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。它是由噬菌体基因43编码
T4 DNA聚合酶基本特征( 图)

3`-5`外切酶活性( 图)

取代合成法标记DNA片段( 图)
在没有dNTPs的情况下, 3`外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能, 它作用于双链DNA, 并按3` －5`的方向从3`－OH末端开始降解DNA。
如果反应物中只有一种dNTPs, 那么这种降解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止, 从而产生出具有一定长度的3`隐蔽末端DNA片段。当反应物中加入标记的32P-dNTPs, 这种局部消化的DNA片段便起到一种引物－模板的作用, T4 DNA聚合酶的聚合作用超过了外切作用, 反应物中32P-dNTPs逐渐取代了被外切活性删除掉的DNA片段上的原有核苷酸——取代合成。
取代合成法制备探针的优点:
不会出现人为的发夹结构( 用缺口转移法制备的探针则会出现这种结构)
应用适宜的核酸内切限制酶切割, 她们便能够很容易地转变成特定序列的探针。
四、 依赖于RNA的DNA聚合酶( 反转录酶)
当前已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶, 但最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶。
它是由α和β两条多肽链组成的:
α多肽链具有转录酶活性5`-3`( 聚合活性) 和RNaseH活性。RNaseH活性是由α多肽链经蛋白酶水解切割后产生的一种多肽片段, 它以5`-3`或 3`-5`的方向特异的降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链;
β多肽链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5`-3`脱氧核酸外切酶活性
它的5`－3`方向的聚合活性, 取决于有一段引物和一条模板分子的存在, 它能够用mRNA为模板。以用mRNA为模板合成cDNA, 是反转录酶的最主要用途。
也能够用单链DNA或RNA作模板合成供实验用的分子探针。
图1: 以RNA为模板聚合互补DNA

图2: 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链

五、 T7 DNA聚合酶
它是从感染了T7噬菌体的大肠肝菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。

T7DNA聚合酶是按两种亚基形式纯化出来的:
其中基因5蛋白质本身是一种非加工的DNA聚合酶, 具有单链的3`-5`核酸外切酶活性。
其二, 硫氧还蛋白, 作为一种辅助蛋白, 增加基因5蛋白质同引物模板的亲和性, 使DNA的加工合成达数千个核苷酸。

另外, T7DNA聚合酶还具有很高的单链及双链的3`-5`核酸外切酶活性。

T7 DNA聚合酶的用途
大分子量模板上引物开始的DNA延伸合成。合成中, 不受DNA二级结构的影响。
同T4 DNA聚合酶一样, T7DNA聚合酶经过单纯的延伸或取代合成标记DNA的3`-末端。
T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶一样, 将双链DNA的3`和5`突出末端, 转变成平末端的结构。

§2.4 核酸酶
一、 核酸外切酶: 一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。
分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶
单链核酸外切酶:
大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ( exoⅠ)
大肠杆菌核酸外切酶( exoⅦ)
双链核酸外切酶:
大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ( exo Ⅲ )
λ噬菌体核酸外切酶( λ exo )

大肠杆菌核酸外切酶( exoⅦ)
它能够从5′-末端或3′-末端降解DNA分子, 产生出寡核苷酸短片段。是一种不需要Mg2+离子的核酸酶 ( 图)

大肠杆菌核酸外切酶( exoⅢ
核酸外切酶Ⅲ的主要活性是, 按3′→5′的方向催化双链DNA自3′-OH末端释放5′-单核苷酸 ( 图)

λ噬菌体核酸外切酶( λ exo ) ( 图)
λ核酸外切酶最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5′-P末端进行逐步的加工和水解, 释放出5′单核苷酸, 但它不能降解5′-OH末端
λ核酸外切酶的用途有两个方面: 第一, 将双链DNA转变成单链的DNA, 供按双脱氧法进行DNA序列分析使用; 第二, 从双链DNA中移去5′突出末端, 以便用末端转移酶进行加尾。

二、 核酸内切酶
1. S1核酸酶
来自从稻谷曲霉, 是一种高度单链特异的核酸内切酶, 它降解单链DNA的速率要比双链DNA快75000倍, 酶活性的表现需要Zn2＋, 最适PH为4.0-4.3。
( 1) 主要功能:
催化RNA和单链DNA分子降解成5`单核苷酸,
作用于双链DNA分子的单链区, 而且这种单链区能够小到只有一个碱基对。
图1: 内切单链DNA或RNA

图2: 内切带切口的或缺口的双链DNA或RNA

( 2) 主要用途:
测定杂种核酸分子( DNA-DNA或RNA-DNA) 的杂交程度。

给RNA分子定位。
测定真核基因中间隔子序列的位置, 探测双螺旋的DNA区域。

从限制酶产生的黏性末端中移去单链突出序列。

打开在双链cDNA合成期间形成的发夹结构等实验操作。

RNA分子定位( 图)
一个RNA分子是由其模板DNA中的400－1400之间的核苷酸序列编码的。这条RNA分子同包含核苷酸400－1400的DNA编码链杂交, 然后再用S1核酸酶处理, 那么RNA－DNA杂种分子中的单链尾巴会被降解掉, 形成一条长度为1000bp的平末端的RNA－DNA杂种分子, 回收这种分子, 便能够测定出这段抗S1核酸酶的DNA片段长度。如果所用的这段DNA是放射性标记的, 其长度可用凝胶放射自显影测定。
2. Bal31核酸酶
来自艾氏交替单胞菌( A.espejiana)
具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
当底物是双链环形DNA, Bal31的单链特异的核酸内切酶活性, 经过对单链缺口或瞬时单链区的降解, 将超盘旋的DNA切割成开环DNA, 进而成为线性双链DNA
当底物是线性双链DNA分子时Bal31双链特异的核酸外切酶活性, 会从5`和3`两末端移去核苷酸。( 图)
Bal31核酸酶的活性需要Ca2＋和Mg2+。
它是分子克隆中十分有价值的工具酶, 其主要用途有:
诱发DNA发生缺失突变;
定位测定DNA片段中限制位点的分布;
研究超盘旋DNA分子的二级结构, 并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构。

诱发DNA发生缺失突变( 图)

定位测定DNA片段中限制位点的分布
先用Bal31核酸酶处理待测的线性DNA片段, 使之以渐进的速度从5`和3`两末端同时降解DNA, 并在不同的时间间隔加入EGTA, 终止Bal31核酸酶的消化作用, 然后用苯酚抽提样品, 再加入我们期望使用的核酸内切限制酶进行在消化。如此按不同时间取样的DNA消化样品, 同只用核酸内切限制酶消化的对照组DNA样品, 一道进行凝胶电泳分析。DNA片段从凝胶中消失的先后次序, 代表这些片段在DNA分子中的前后排列位置。根据这些结果, 便能够把这些DNA片段按正确的顺序排列出来, 并确定出有关限制酶的识别位点。

§2.5 核酸修饰酶
一、 末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)
末端脱氧核苷酸转移酶能够催化5`-脱氧核苷三磷酸进行5`向3`方向的聚合作用, 逐个的将脱氧核苷酸分子加到线性分子的3`-OH末端, 可是它不需要模板, 4种dNTPs都能够作为它的前体。
接受核苷酸聚合的受体DNA, 能够是具有3`-OH末端的单链DNA, 也能够是具有3`-OH末端的双链DNA
平末端不是末端脱氧核苷酸转移酶的有效底物, 但如果用Co2+取代Mg2+离子作为辅助因子, 便能够成为它的有效底物。
( 图)
末端脱氧核苷酸转移酶的主要用途
分别给外源DNA分子及载体片段加上互补的同聚物尾巴, 以使她们能够重组起来。
例如: 给载体的线性分子的3`-OH末端加上poly( dG) 尾巴, 同时给待克隆的外源DNA片段的3`-OH末端加上poly( dC) 尾巴, 于是这两条DNA分子便能够经过互补尾巴的碱基配对而彼此连接起来, 最后再用连接酶将单链缺口封闭起来。
二、 碱性磷酸酶
来自小牛肠的碱性磷酸酶( CIP)
来自大来自大肠杆菌的碱性磷酸酶( BAP)
她们的共同作用是催化核酸分子脱掉5`磷酸基团, 从而使DNA片段的5`-P末端转化为5`-OH末端, 这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
分子克隆中的应用: 经碱性磷酸酶处理的质粒线性DNA分子失去了自身环化能力, 但仍能与具5¢-P和3¢-OH的外源DNA片段重组, 并在转化到受体细胞后完成Nick的修复工作。

CIP具有明显的优点, 它在SDS中加热至68℃就会完全失活; 而BAP是热抗性, 要终止其作用就很困难;

CIP活性要比BAP高出10～20倍, 因此实验中一般使用CIP。

三、 T4-多核苷酸磷酸激酶( T4-PNP) ( 图)
基本特性:

用途:

习题练习
1．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时, 出现了星号活性, 请分析可能的原因?

2．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列, 该位点的序列可能是什么?

3．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列:
GAATCG, AAATTT, GATATC, ACGGCA? 为什么?

4．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时, 若要进行双酶切, 应采取什么措施?为什么?

5.DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用?
6..DNA连接酶在什么情况下使用? 如何将不同DNA分子末端进行连接?
7..碱性磷酸酶有什么作用?
8. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用?