丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化.docx
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1、丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化【摘要】 目的分析丁酸钠诱导Raji细胞的基因表达变化,探讨丁酸钠诱导凋亡作用机制。方法限制性显示PCR技术(Restriction Display PCR,RDPCR)分析基因表达变化,利用互联网提供的GenBank核酸数据库分析比对获得的差异表达序列。结果获得14条差异表达序列,其中6条是对照组高表达序列,8条是实验组高表达序列。结论采用RDPCR技术可以快速简便地分析药物诱导基因表达变化。分析表达差异的序列发现,丁酸钠可诱导促进细胞凋亡的基因表达,降低肿瘤细胞高表达的基因表达。【关键词】 限制性显示PCR技术;丁酸钠;凋亡;基因表达Change of
2、Gene Expression in Raji Cells Induced by Sodium ButyrateAbstract:Objective This study was designed to analyze the change of gene expression and investigate the mechanism of apoptosis induced by sodium butyrate. MethodsThe change of gene expression was analyzed by Restriction Display PCR .The differe
3、nces expressed sequences were sequenced. Nucleic acid sequences were analyzed by using the GenBank in internet. ResultsFourteen differential expressed sequences were gained, of which 6 high expressed sequences were in control cells and 8 high expressed sequences were induced by sodium butyrate. Conc
4、lusionThe change of gene expression induced by drugs could be analyzed RDPCR methods quickly and simply. Gene expression that prompted cell apoptosis was upregulated induced by sodium butyrate while Gene expression that was high expression in tumor cells was downregulated.Key words:Restriction Displ
5、ay PCR; Sodium butyrate; Apoptosis; Gene expression0引言Raji细胞是悬浮状态生长的,但我们前期研究发现Raji细胞在丁酸钠的处理下可由悬浮生长状态转变为贴壁生长状态,伴随有细胞凋亡现象的发生1。我们研究小组拟通过RDPCR显示mRNA表达差异来揭示丁酸钠诱导Raji细胞凋亡时基因表达的变化,试图寻找造成细胞发生形态学变化的主要基因,探讨丁酸钠作用的可能机制。1材料和方法主要试剂丁酸钠(SB), 溴化乙锭; DNA回收试剂盒; mRNA纯化试剂盒, 限制性内切酶Sau3AI, DNA连接试剂盒, LA Tag酶, RNasin, T4 DNA
6、 连接酶, dNTP, PMD18T Vector, JM109细菌; 丙烯酰胺, N, N甲叉双丙烯酰胺, 琼脂粉, 琼脂糖, Tag酶, 低熔点琼脂糖; 胰蛋白胨, 酵母提取物(英国OXIOD公司); Tris饱和酚; 逆转录酶, TRIzol试剂, DEPC; RPMI1640; 小牛血清; 100bp DNA Ladder; 氯仿, 异丙醇。细胞培养Raji细胞株(来源于中山大学肿瘤防治中心)以含10%小牛血清的RPMI1640培养液于5% CO2中培养。细胞mRNA的提取将生长状况良好的Raji细胞接种在6孔培养板中,细胞浓度为106/ml,加入3mmol/L丁酸钠,37、5% CO
7、2培养。总RNA的提取按照Invitrogen公司提供的TRIzol试剂说明书进行操作。最后加30l DEPC处理水溶解总RNA。参照mRNA纯化试剂盒说明书操作,从总RNA中纯化mRNA。从mRNA反转录成为cDNA及双链cDNA末端平滑化 逆转录按照Invitrogen公司的说明书进行逆转录,mRNA约2g,dNTP /L,Oligd T15 mol/L,65,5min,加MMLV 200U和酶反应缓冲液,37延伸时间75min。cDNA样品20l,70,10min。加入5l T4 DNA Polymerase, 5l 10T4 DNA Polymerase Buffer,5l % BSA
8、,l /L dNTP,l灭菌水,轻柔混匀。37反应5min。加入25l EDTA(pH ) 和25l 10%的SDS,轻柔混匀,停止反应。加入100l酚/氯仿溶液,振荡,混匀。10000g离心1min,液相分离,将上层水相转移至另一微量离心管中。加入1/10体积3mol/L NaAc、倍体积预冷的无水乙醇,混匀。-20,静置30min。4离心13000g10min,弃上清,75%乙醇洗沉淀12次,晾干。的酶切cDNA溶于20l水中,定量后,取大约2 g进行酶切反应。16U Sau3AI,37进行酶切反应,时间不少于2h。接头与cDNA酶切片段的连接采用PCR引物设计软件设计两条单链寡核苷酸片段
9、来生成接头,sip:5pGATCCACACCAGCCAAACCCA3,SIR: 5GGTTTGGCTGGTGTG3。接头生成按如下进行:SIP(500g/ml in water)20l,SIR(380g/ml in water)20l。混合后,90,80,70,60,50,40,30,20,4保持。分装后,贮藏于-20备用。接头与cDNA酶切片段的连接参照TaKaRaDNA连接试剂盒说明及所提供的试剂,步骤cDNA酶切反应液5l,接头5l,SolutionII 10l,SolutionI 20l。混合均匀后,于16连接,时间不少于1h。PCR反应用引物设计软件设计与SIR/SIP接头配套的通用
10、引物U,其序列为GGTTTGGCTGGTGTG。设计的限制性引物是在通用引物的GATC3 端分别加上一个碱基A、T、C、G,以下简称为引物A、T、C、G,引物序列如表1。表1 RDPCR的限制性引物将引物A、T、C、G两两组合,共有10组,以接头与cDNA酶切片段的连接产物为模板,进行限制性分组PCR反应,反应条件 97 2min;95 30s,65 30s,72 1min,共35个循环; 72 5min; 4保持。扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳。经EB染色后,在紫外灯下观察实验组与对照组的基因表达差异,参照DNA回收试剂盒说明书回收差异条带。纯化后PCR产物与载体连接转化测序将纯化
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