家族性与散发性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性研究.docx
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1、家族性与散发性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性研究【摘要】 目的: 通过聚合酶链式反应、基因测序技术及TDIFP技术,检测散发性与家族性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性,探讨Parkin基因突变在PD发病机制中的作用,同时建立一种新的突变检测方法.方法: 以36例家族性及114例散发性PD患者为实验对象,150名正常健康人为阴性对照,通过PCR扩增含Parkin基因4号外显子的DNA片段,电泳分析初次筛选片段缺失者.基因测序技术对无缺失片段进行克隆、测序,筛选出突变型及野生型.最后应用TDIFP技术检测R110或TAMRA标记ddNTP的FP值,鉴定Parkin基因
2、4号外显子的基因点突变型.结果: 在36例家族性PD患者中共发现10例4号外显子缺失突变,占27,点突变有4例,占11%;114例散发性PD患者中仅有2例4号外显子缺失突变,占1%,而点突变则有48例,占42%.150例阴性对照组中无缺失突变,点突变10例,占6%.结论: Parkin基因突变可能是PD发病的重要因素之一,而散发性与家族性帕金森病具有不同的突变类型,可能与其具有不同的发病机制相关联.【关键词】 帕金森病;基因,突变;外显子0引言Parkin基因是目前研究发现与帕金森病发病密切相关的遗传易感基因之一,该基因包括12个外显子,有多处突变,其中以4号外显子为主,该外显子处于Parki
3、n基因的突变热点区域.对该外显子的突变规律的研究对于揭示PD的遗传学特性具有重大指导意义.1资料和方法11临床资料实验组PD患者150,平均年龄岁,平均发病年龄岁.包括36例家族性及114例散发性PD患者均为1999-02/2003-06我科住院接受苍白球或丘脑毁损手术的患者,符合第一届全国锥体外系会议制订的PD诊断标准.全部病例均无血缘关系.具有家族遗传病史的患者中母系遗传16例,源自父系14例,同时有母系和父系家族史者2例,无法判明是母系还是父系4例.全部实验组中早发型PD 40例.对照组150例系门诊健康查体者,排除锥体外系及其他神经系统变性疾病,其性别及年龄分布两组间无显着性差异.1
4、2方法121提取基因组DNA抽取患者及对照组肘静脉血2 mL,加05 mL的20 mL/L EDTA抗凝,应用ReadyPCRTM(华美公司生产)全血基因组DNA纯化系统提取全血基因组DNA.122目标DNA片段的提取应用PCR扩增技术对Parkin基因4号外显子进行扩增.从Medline查Genbank,参照Parkin基因的序列,应用DNA Star软件设计exon 4引物.上游引物序列为: 5TGCAGCATTATTAGCCACTTCTT3,下游引物序列为: 5TTCGGCTATCATTAACTATCACAA3.反应体系为: MgCl2、dNTPS、10buffer 各25 L,P1和P
5、2各1 L,Taq聚合酶1单位.加水补足25 L.反应条件为94变性10 min;55退火30 s,72延伸30 min; 进行40个循环, 72延伸10 min.取5 L PCR扩增产物在15 mL/L琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色、显带,观察条带缺失情况.123基因测序分析分别对家族性、散发性及阴性对照组中未出现exon 4缺失突变的PCR扩增序列5例进行分子克隆,方法: 对DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收,与T载体连接,体系 T载体1 L,目的片段4 L,solution5 L16 14 h.转化大肠杆菌DH5a 涂Amp 板子.挑单克隆,37 摇匀过夜提质粒.酶切鉴定.送上海博雅生物技术有限
6、公司对其DNA进行测序,筛选出阳性对照及阴性对照.124突变位点的SNP测定应用TDIFP技术,测定Parkin基因4号外显子的601位GA的突变.参考国外文献的上下游碱基引物序列,确定SNP引物5CGGGAAAACTCAGGGTACAGTGCA3进行突变位点的末端碱基荧光偏振插入,确定突变碱基类型.微孔板每孔加入5 L PCR扩增产物,加入2 L 1PCR消化酶,37反应1 h,清除游离的PCR引物P1和P2及dNTPs;80水浴15 min,失活PCR消化酶.随后每孔加入13 L AcycloPrimeFP混合物.方法: 将微孔板置于热循环仪,95预变性2 min,95 15 s, 63
7、30 s,共25个循环;室温15 min.微孔板在wallac 1420、 VICTOR2TM1420 multilabel counter上分别检测R110和TAMRA的FP值.2结果21初次PCR扩增结果在36例家族性PD患者中共发现10例4号外显子缺失突变,占27,114例散发性PD患者中仅有2例4号外显子缺失突变,占1%, 150例阴性对照组中无缺失突变.图1Parkin基因第4号外显子PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析略图2G601-A TDI-FP检测结果略22TDIFP检测Parkin基因4号外显子突变检测,36例家族性PD患者中发生601位点GA突变型有4例,占11%;114例
8、散发性PD患者中发生601位点GA突变型则有48例,占42%.150例阴性对照组中601位点GA突变型10例,占6%.23基因测序分析Parkin基因4号外显子的PCR产物与T载体重组克隆扩增后,送上海博雅生物技术有限公司对其DNA进行测序,结果显示,15例基因测序结果与TDIFP检测的601位GA突变型及野生型结果完全一致.3讨论PD的发病机制迄今尚未完全明确,目前认为是遗传因素与环境因素共同作用的结果.有证据表明,长期接触锰、有机氯等化学物质的人帕金森病患病率高,吸毒人员吸食MPTP引起与帕金森病相同的神经病理变化和临床表现.因此,环境毒素在体内蓄积对神经元的破坏引起帕金森病的假设得到了多
9、数学者的认同.但近年来随着基础研究的日益深入,遗传因素在PD发病中的作用日益引起人们的关注,因为单纯环境因素无法解释为什么人群中许多具有相同环境暴露的个体并不都患病,提示个体存在对帕金森病易感性的差异.遗传易感性是由遗传易感基因决定的,目前发现与PD发病相关的基因有多种,但Parkin基因是研究证实与PD发病确切相关的基因之一.该基因位于第6号染色体长臂的25227区,位于遗传标记D6S305和D6S253之间2.与帕金森病的常染色体隐性遗传有关.整个基因长度有5 000 000 bp,是迄今发现最长的遗传基因,包括12个外显子,其核心编码区为2960 bp的核苷酸序列构成,其中含有一个139
10、5 bp的开放阅读框架,编码一个包含有465个氨基酸的蛋白质,即Parkin蛋白.该蛋白具有两个环指样结构和一个泛素结构域,核心区域包括37个外显子,编码具有76个氨基酸的多肽,可与细胞蛋白共价结合,形成一个分枝多聚泛素链,与26降解的蛋白片段相连接,形成淀粉样沉淀物.Parkin蛋白在泛醌水解酶E3和UbcH7、UbcH8中起重要作用.而其他与PD发病相关的基因如a共核蛋白基因等所编码的蛋白也是Parkin蛋白的靶蛋白之一.Exon 4位于Parkin基因核心编码区中的514635 bp之间,共122 bp.编码Parkin蛋白氨基酸序列138178位.目前研究发现其601位碱基GA的突变,
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